目的 探讨针对p27Kip1基因的小发夹RNA(shRNA)表达质粒对牛角膜内皮细胞(bCEC)增殖能力的影响.方法 实验研究.设计有发夹状结构的3条p27Kip1-shRNA对应模板DNA序列,并构建无关序列HK-shRNA作为阴性对照.构建并鉴定重组质粒Pgenesil-P1、Pgenesil-P2、Pgenesil-P3及Pgenesil-HK.以脂质体法将以上4种质粒分别转染bCEC,并设立空白组.稳定转染后采用RT-PCR和Western免疫印迹法榆测bCEC内p27Kip1的mRNA及其蛋白水平,筛选出抑制效果最好的阳性siRNA质粒.用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测该质粒组、Pgenesil-HK组及空白组的细胞生长情况.流式细胞术检测各组细胞周期的分布.以上数据结果均采用单因素方差分析.结果酶切及测序证实4个重组质粒均构建成功.与空白组比较,Pgenesil-P1、Pgenesil-P2、Pgenesil-P3各组mRNA的抑制效率分别为32.71%、67.76%及80.28%(F=453.102,P=0.000),蛋白表达水平降低为29.27%、64.73%及76.13%(F=75.385,P=0.000),以Pgenesil-P3抑制效果最明显.空白组与Pgenesil-HK组比较蛋白水平(P=0.356)和mRNA水平(P=0.246)均差异无统计学意义.与空白对照和阴性siRNA相比,Pgenesil-P3组bCEC增殖能力提高,G1期细胞比例下降(F=134.224,P=0.000),s期比例增加(F=334.957,P=0.000).结论针对p27Kip1的shRNA可有效降低p27Kip1基因及其蛋白的表达水平,并可提高bCEC增殖能力.RNA干扰介导的p27Kip1基因沉默可能是促进角膜内皮细胞再生的有效手段.(中华眼科杂志,2009,45:254-259)
针对p27Kip1基因的小发夹RNA对牛角膜内皮细胞增殖的影响
【摘 要】
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目的 探讨针对p27Kip1基因的小发夹RNA(shRNA)表达质粒对牛角膜内皮细胞(bCEC)增殖能力的影响.方法 实验研究.设计有发夹状结构的3条p27Kip1-shRNA对应模板DNA序列,并构建无关序列HK-shRNA作为阴性对照.构建并鉴定重组质粒Pgenesil-P1、Pgenesil-P2、Pgenesil-P3及Pgenesil-HK.以脂质体法将以上4种质粒分别转染bCEC,并设
【机 构】
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430022,武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院,430022,武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院,武汉爱尔眼科医院,430022,武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院,430022,
【发表日期】
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2009年45期
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