【摘 要】
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目的 克隆问号钩端螺旋体(简称钩体)鞭毛相关蛋白编码jliH、fliⅠfliH、和fliN并构建其原核表达系统,制备表达产物抗血清并了解其蛋白的定位.方法 以苯酚-氯仿法提取的问号钩
【机 构】
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浙江大学医学院病原生物学系,浙江省绍兴文理学院医学院,浙江大学医学院电镜室
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目的 克隆问号钩端螺旋体(简称钩体)鞭毛相关蛋白编码jliH、fliⅠfliH、和fliN并构建其原核表达系统,制备表达产物抗血清并了解其蛋白的定位.方法 以苯酚-氯仿法提取的问号钩体黄疸出血群赖型赖株基凶组DNA为模板,用PCR扩增全长fliH,fliⅠ,firY和flfliN基因片段,T-A克隆后测序,继而构建上述目的 基因克隆的原核表达系统.采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图像分析系统检查重组蛋白rFliH、rFliI、rFliY和rHiN的表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯目的 表达产物.皮下免疫家兔获得4种目的 重组蛋白抗血清,用ELISA和Western blot分别检测抗血清效价并了解抗血清与相应抗原结合的能力.采用免疫电镜技术对FliH、FliⅠ、FliY和FliN进行定位.结果 PCR扩增获得大小分别为924、1365、1065和318 bp的全长fliH,fliⅠ,fliY和fliN基因片段,与报道的序列比较.其核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.所构建的原核表达系统均能有效地表达目的 重组蛋白,其产量均约为20%.rFliH、rFliⅠ、rFliY和rHiN蛋白免疫家兔后能产生抗体,其兔抗血清ELISA效价达到1:100 000以上,并分别识别钩体相应重组蛋白和膜蛋白提取物而出现明显的Westem杂交条带.FiH、FliⅠ、FliY和FliN蛋白分布于问号钩体内膜、外膜或内外膜之间.结论 本研究成功地构建了能高效表达问号钩体鞭毛相关蛋白FliH、FliⅠ、FIiY和HiN的原核表达系统,并获得了能有效识别上述蛋白抗原的高效价抗血清.鞭毛相关蛋白HiH、Flil、FliY和FIiN是问号钩体内膜或外膜蛋白成分.
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