【摘 要】
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目的 研究淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)酶解过程,构建含有Swedish和APP717两种突变的荧光真核表达系统.方法 以pcDNA3.0-APP为模板,通过聚合酶链式反应(PC
【机 构】
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首都医科大学附属北京安贞医院神经内科,华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,华中科技大学生命科学院
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目的 研究淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)酶解过程,构建含有Swedish和APP717两种突变的荧光真核表达系统.方法 以pcDNA3.0-APP为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)得到含有APP717突变的APP最后300个碱基片段(C99);以pcDNA3.0-CFP-CaM-YFP酶切产物为模板,通过PCR分别得到编码蓝色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)碱基序列;生物合成含有Swedish突变的APP中间54个碱基片段(54 bp).利用基因工程技术将CFP、54 bp、YFP、C99片段克隆至载体质粒pcDNA3.0中,通过酶切、PCR、测序鉴定最终得到重组质粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99和pcDNA3.0-CFP-54 bp-YFP,并将其转染至人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞中,利用多光子共聚焦显微镜观察荧光表达,检测荧光共振能量转移(FRET)以及免疫细胞化学染色观察B淀粉样蛋白(Aβ).结果 (1)基因序列分析证明重组质粒构建成功.(2)利用多光子共聚焦显微镜观察转染细胞,显示融合基因能够准确表达蓝色和黄色荧光.(3)表达CFP-54bp-YFP的细胞有FRET现象,而表达CFP-54bp-YFP-C99的细胞中观察不到FRET现象.(4)利用多光子共聚焦显微镜发现CFP-54bp-YFP-C99转染的细胞中有YFP标记的A13产生并沉积在胞质胞膜以及细胞间隙中.(5)免疫细胞化学检测证实CFP-54bp-YFP-C99经过裂解可以产生Aβ,Aβ在细胞膜、细胞质、细胞间隙聚集沉积.结论 (1)融合基因的表达产物能够完成APP的有序裂解产生Aβ.(2)Aβ有可能产生于APP由胞质至胞膜的运输过程中.(3)研究显示C99对于APP被裂解有重要意义,可能起到信号肽样的引导定位作用.(4)在细胞外形成沉积之前,Aβ已经在细胞内聚集导致细胞形态改变.
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