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摘 要 木薯单爪螨（Mononychellus mcgregori）是新入侵中国的木薯重要害螨，原产地为南美洲，是一种热带土著害螨，近年来该螨扩张范围不断增大，对高温的适应性是其种群扩散的重要前提。本研究发现，42 ℃极端高温胁迫1 h后，木薯单爪螨成螨保护酶基因PPO、POD、AsA-POD、CAT和Cu/Zn SOD的相对表达量显著升高，分别高达对照的5.19、4.38、152.23、321.42和3.41倍，且与其酶活性变化趋势存在一致性，酶活性值分别升高为对照的1.81、12.52、9.00、1.75和1.14倍。热激蛋白基因Hsp70的相对表达量显著升高，为对照的56.85倍。因此说明，保护酶POD、AsA-POD、CAT、SOD和PPO以及热激蛋白Hsp70可能在木薯单爪螨应对高温胁迫中具有重要作用，高温下保护酶及热激蛋白Hsp70基因表达量及其活性的升高可能导致木薯单爪螨对高温的耐受能力逐渐增强，从而逐渐适应热区高温环境，并可能增强其后续的繁殖能力而使其种群不断增长，扩张范围不断增强。
关键词 木薯单爪螨；高温；保护酶；热激蛋白；基因表达；酶活性
中图分类号 S533 文献标识码 A
Abstract Cassava green mite Mononychellus mcgregori is a newly invasive pest mite of cassava in China. It was reported the first time in Danzhou， Hainan， China in 2008 and has since become more widespread. The origin of M. mcgregori is South America and as a tropical native mite， the adaptation to high temperature is the significant foundation for its occurrence and damage. The results showed that the relative expression of PPO， POD， AsA-POD， CAT and Cu/Zn SOD genes in M. mcgregori via RTFQ PCR increased in adults after they were exposed to extremely high temperature（42 ℃）for 1 h， which increased 5.19， 4.38， 152.23， 321.42 and 3.41 times over that of the control， respectively， and were in accord with their enzyme activities（1.81， 12.52， 9.00， 1.75 and 1.14 times over that of the control）. And the relative expression of heat shock protein 70（Hsp70）gene increased 56.85 times over that of the control. These results suggested that protective enzymes POD， AsA-POD， CAT and SOD were associate with the thermostability of M. mcgregori and they might have synergistic effects on protect the mite against toxic oxygen intermediates and perhaps were associate with the resistance of high temperature in M. mcgregori. The increasing of PPO gene expression was perhaps associated with the immunity improvement of the mite to high temperature stress. And the elevated expression of Hsp70 gene was perhaps related to the adaptation of M. mcgregori to high temperature. These results provide a theoretical basis and precondition for further research on the molecular mechanisms of the thermostability and ecological adaptability of M. mcgregori.
Key words Mononychellus mcgregori； extreme high temperature； protective enzymes； heat shock protein； gene expression； enzyme activities
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.05.022
木薯单爪螨（Mononychellus mcgregori）原产地为南美洲，是一种热带土著害螨，对高温的适应性是其种群扩散的重要前提。该螨自2008年首次在中国海南发现，目前调查发现，其已在广西、广东、云南等省区广泛分布，且其发生期从入侵之初的仅在冬、春季发生而目前已发展到全年发生为害，已逐渐对中国发生区的气候环境产生适应。近年来该螨亦开始在泰国、柬埔寨和越南在内的亚洲国家木薯种植区扩散为害[1]。研究表明，木薯单爪螨对高温却相對敏感，36 ℃及以上高温胁迫1 h即可影响该螨的发育与繁殖，使其成螨产卵量减少，卵孵化率降低，42 ℃极端高温暴露1 h为木薯单爪螨热最敏感时间[2]。耐热性决定了昆虫的地理分布区域，研究表明，起源于热带及相对较干地区的昆虫种类具有更高的耐热性[3]。极端高温对昆虫种群地理分布、种群统计参数和种群增长、行为及种间关系等均存在显著影响[4-6]。赤足叶螨（Halotydeus destructor）在从南非入侵澳大利亚后，移动温度上限（HMT）和热昏迷温度（HCT）均显著升高，因此导致其在澳大利亚的地理分布范围扩大，并向更低维度地区扩散分布[7]。42 ℃高温处理4～6 h后，山楂叶螨成螨的产卵量和寿命均未受显著影响，39 ℃以上高温冲击会导致山楂叶螨种群数量迅速增加，这是导致山楂叶螨多在中国北方各地高温季节猖獗危害的直接诱因之一[8]。本研究对42 ℃极端高温胁迫1 h后木薯单爪螨各龄螨几种保护酶（PPO、POD、AsA-POD、CAT和SOD）基因表达与活性的差异以及热激蛋白Hsp70基因的表达做了分析，以探讨极端高温对木薯单爪螨的影响机制，为进一步研究其生态适应性及其机制，以及更好地监测其发生与扩散范围奠定基础。 1 材料与方法
1.1 材料
供试木薯单爪螨来源于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所特色热带作物害虫课题组室内木薯叶片继代饲养的实验种群。
1.2 方法
1.2.1 极端高温胁迫试验 将蜕皮12 h以内的木薯单爪螨幼螨、前若螨、后若螨及成螨分别以每叶100头接到清洗干净的新鲜木薯叶片上，置于温度为（42±1）℃，湿度均为75%±5%、光周期12（L） ∶ 12（D）的人工气候箱中，1 h后取出，提取总RNA，每个龄期处理6 000～12 000头。以室温（25±1）℃处理作为对照。
1.2.2 保护酶基因表达量的定量PCR测定 木薯单爪螨总RNA的提取参照Trizol RNA提取试剂盒进行[9]。总RNA经纯化去除基因组DNA，并经过浓度、纯度与完整性检测后，使用TOYOBO反转录试剂盒进行cDNA的合成。cDNA样品经nuclear-free水10倍稀释后作为荧光定量PCR的模板，以β-actin基因为内参基因，相关基因的引物信息见表1。PCR反应在ABI PRISM 7700PCR仪进行，扩增条件见表2。回收扩增基因片段，制作标准曲线和熔解曲线。根据Pfaffl的2-ΔΔCt方法计算42 ℃极端高温胁迫1 h后保护酶PPO、POD、AsA-POD、CAT和SOD基因及热激蛋白Hsp70基因的相对表达量[10]。
1.2.3 保护酶活性测定 保护酶PPO、POD、AsA-POD、CAT和SOD活性测定参照Lu等[11]方法。
1.3 数据处理
检测结果进行标准曲线分析，以对目的基因进行定量，用样品的目的基因测得值除以内参基因测得值以校正误差，所得结果表示目的基因相对含量。在Microsoft Excel中进行相对定量数据统计处理。用SPSS软件duncan’s新复极差法比较分析42 ℃极端高温处理1 h后木薯单爪螨保护酶PPO、POD、AsA-POD、CAT和Cu/Zn SOD基因和热激蛋白Hsp70基因的相对表达量与对照间的比值差异，并比较分析保护酶PPO、POD、AsA-POD、CAT和SOD基因表达与酶活性间的差异。
2 结果与分析
2.1 42 ℃极端高温胁迫1 h对木薯单爪螨保护酶基因相对表达量的影响
2.1.1 42 ℃极端高温胁迫1 h对木薯单爪螨PPO基因相对表达量的影响 经42 ℃极端高温胁迫1 h后，木薯单爪螨前若螨和成螨PPO基因相对表达量显著升高（p<0.05），分别升高为对照的13.88和5.19倍，而幼螨和后若螨PPO基因相对表达量却降低为对照的0.34和0.16倍（图1）。
2.1.2 42 ℃极端高温胁迫1 h对木薯单爪螨POD基因相对表达量的影響 经42 ℃极端高温胁迫1 h后，木薯单爪螨POD基因相对表达量在除前若螨外的其他各龄螨体内显著升高（p<0.05），分别升高为对照的2.41倍（幼螨），2.83倍（后若螨）和4.38倍（成螨）（图2）。而前若螨POD基因的相对表达量却降低为对照的0.37倍。
2.1.3 42 ℃极端高温胁迫1 h对木薯单爪螨AsA-POD基因相对表达量的影响 各龄木薯单爪螨经42 ℃极端高温胁迫1 h后，体内AsA-POD基因相对表达量在幼螨、前若螨和后若螨体内显著降低，而在成螨体内则极显著升高（图3，p<0.01）。其中幼螨、前若螨和后若螨体内AsA-POD基因的相对表达量分别降低为对照的0.25，0.15和0.82倍，而成螨AsA-POD基因的相对表达量却比对照升高152.24倍。
2.1.4 42 ℃极端高温胁迫1 h对木薯单爪螨CAT基因相对表达量的影响 各龄木薯单爪螨经42 ℃极端高温胁迫1 h后，体内CAT基因相对表达量除前若螨显著降低外，其他各龄期均显著升高（图4）。幼螨、后若螨和成螨CAT基因相对表达量分别比对照升高27.27、63.64和321.42倍，而前若螨CAT基因相对表达量却降低为对照的0.40倍。
2.1.5 42 ℃极端高温胁迫1 h对木薯单爪螨Cu/Zn SOD基因相对表达量的影响 各龄木薯单爪螨经42 ℃极端高温胁迫1 h后，体内Cu/Zn SOD基因相对表达量均具有升高趋势（图5），幼螨、前若螨、后若螨和成螨Cu/Zn SOD基因分别升高为对照的1.16、2.98、2.67和3.41倍。
2.2 42 ℃极端高温胁迫1 h后木薯单爪螨保护酶基因表达量与活性比较
42 ℃极端高温胁迫不同发育阶段木薯单爪螨1 h后，其体内保护酶PPO、POD、AsA-POD、CAT和Cu/Zn SOD基因的相对表达量和酶活性发生了显著变化（图6～10）。其中，所有检测保护酶PPO、POD、AsA-POD、CAT和SOD在成螨体内的基因相对表达量和活性均显著升高，与对照相比，其升高倍数分别为5.19倍和1.81倍，4.38倍和12.52倍，152.23和9.00倍，321.42倍和1.75倍，3.41倍和1.14倍，虽然CAT基因的相对表达量极显著升高（图9，p<0.01），且为最高值，但其活性仅升高为对照的1.75倍，而AsA-POD基因相对表达量与酶活性均极显著高于对照（图8）。在幼螨和若螨体内，Cu/Zn SOD基因表达均显著升高（p<0.05），但酶活性却无显著变化（图10）。POD和CAT基因表达在幼螨和后若螨体内显著升高，但其酶活性却仅在幼螨体内显著升高（p<0.05）；而在前若螨体内，POD基因表达降低，活性无显著变化，CAT基因表达和酶活性均显著降低（图7和图9，p<0.05）。PPO基因表达量与酶活性仅在前若螨体内显著升高（图6，p<0.05）。相比之下，AsA-POD基因表达却在幼螨和若螨体内显著降低，酶活性在前若螨和后若螨体内无显著变化，但在幼螨体内显著升高（图8，p<0.05）。说明不同龄期对高温的敏感性与应对机制可能存在不同。 2.3 42 ℃极端高温胁迫1 h对木薯单爪螨Hsp70基因相对表达量的影响
各龄木薯单爪螨经42 ℃极端高温胁迫1 h后，其体内Hsp70基因相对表达量极显著升高（图11，p<0.01），达对照的56.85倍，而幼螨、前若螨和后若螨体内Hsp70基因相对表达量均显著下降，分别降低为对照的0.51、0.11和0.000 64倍。
3 讨论
产生抗氧化反应和诱导热激蛋白基因（HSPs）的表达，是昆虫（螨）抵抗热胁迫的重要生理机制[12]。研究表明，热胁迫会诱导抗氧化酶基因的表达[13-15]。本研究结果显示，42 ℃极端高温胁迫不同发育阶段木薯单爪螨1 h后，其体内保护酶基因PPO、POD、AsA-POD、CAT和Cu/Zn SOD的相对表达量在成螨体内均显著升高，其中最高为CAT基因，相对表达量达对照的321.42倍，其次为AsA-POD基因，达对照的152.23倍，且基因的表达和其活性的升高存在一致性。本研究结果与Barthell等[16]和Foyer等[17]热胁迫会诱导生物体胞质内AsA-POD基因的转录活性，同时导致AsA-POD活性的升高研究发现部分一致。研究表明，在逆境中，AsA-POD的表达量增加，同时，大量AsA-POD的增加可以增加POD活性，从而加强了自由基清除系统，导致生物体对氧化压力的耐受性增强[18]，本研究结果也证实42 ℃极端高温胁迫1 h既增加了木薯单爪螨成螨AsA-POD基因的表达和活性，也增加了POD基因的表达和酶活性，这可能是其响应极端高温胁迫的一种保护机制之一。研究表明，抗氧化酶（SOD、CAT以及POD等）系统在柑橘全爪螨、家蚕及南极蚊等昆虫抵抗热冲击中发挥着重要的作用[19-21]。PPO是昆虫体内重要的免疫蛋白，在昆虫对外界伤害的免疫和防御过程中发挥着重要作用[22-28]。因此，结合42 ℃极端高温胁迫对木薯单爪螨发育和繁殖存在显著影响[11]，保护酶POD、AsA-POD、CAT和SOD基因表达量及其酶活性的升高可能在木薯单爪螨成螨对高温的适应性中发挥了重要的作用。在不利环境条件胁迫下，热激蛋白（Hsp）具有应激保护细胞的作用[29]，Hsp70是热和其他应激所能诱导出的作用最为显著的蛋白质之一[30]。本研究也发现，极端高温胁迫不同发育阶段木薯单爪螨1 h后，成螨体内热激蛋白基因Hsp70的相对表达量显著升高。研究表明，果蝇的幼虫和蛹Hsp70蛋白在太阳光照射后大量表达，这种表达使果蝇可抵抗40 ℃高温[31]。崔旭红[32]研究表明，Hsp70在B型烟粉虱抵抗高温胁迫中发挥了重要作用，对其机制的研究有利于揭示B型烟粉虱及其他入侵害虫的种群形成与扩张机制，对B型烟粉虱的可持续控制具有重要的理论和实践意义。
昆虫对热胁迫的耐受力及对生活环境的极端高温及其临界耐受最高温度决定了其种群的时空分布范围[5，33]。研究表明，朱砂叶螨为适应环境胁迫，尤其是高温等胁迫，发展了其耐胁迫能力，从而增加了其种群对高温的适应能力，增加了种群在高温环境下的适合度[34]。柑橘全爪螨种群的季节动态变化，可能是其对温度变化的一种适应性反应[19]。外来入侵物种对温度胁迫耐受能力的高低对其入侵新环境后的扩散以及种群动态具有重要影响[35]。高温适应性的生理生化及分子机制对揭示外来物种种群扩张、种间替代和种群生态预测均有重要的理论和实践意义[32]。目前，因气候变化所导致的极端高温及其影响问题已备受世界关注[12，36-38]，而作为入侵害螨，木薯单爪螨自近年入侵中国热区后，种群数量在不断增加，扩散速度在不断加快[11]。抗氧化酶和热激蛋白Hsp70基因表达量的升高可能导致成螨对高温的耐受能力逐渐增强，从而增强其后续的繁殖能力而使其种群不断增长，扩张范围不断增强。因此，本研究可为了解木薯单爪螨入侵中国后的生态适应性及其种群扩张机制，进一步探讨木薯单爪螨耐热性的分子机理及其生态适应性机理提供了理论依据和前期工作基础，并為木薯单爪螨的有效防控提供技术支撑。
此外，研究昆虫抗氧化酶抑制剂对克服和延缓害虫害螨抗性有重要的意义，适宜昆虫抗氧化酶抑制剂的研制，将使昆虫或螨类体内抗氧化酶的活性在一定的逆境（如高低温、寄主等）胁迫条件下不发生变化，进而延缓昆虫的抗逆适应性，将对害虫害螨的有效治理产生重要意义[39]。因此，本研究亦可为木薯单爪螨抗热治理提供理论依据。
参考文献
[1] Bellotti A， Vanessa H C， Hyman G. Cassava production and pest management： present and potential threats in a changing environment[J]. Tropical Plant Boil， 2012， 5（1）： 39-72.
[2] 卢芙萍， 符悦冠， 陈 青， 等. 温度对木薯单爪螨生长发育与繁殖的影响[J]. 热带作物学报， 2011， 32（9）： 1 720-1 724.
[3] Kellermann V， Overgaard J， Hoffmann A A， et al. Upper thermal limits of Drosophila are linked to species distributions and strongly constrained phylogenetically[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2012， 109（40）： 16 228-16 233.
[4] Garcia-Robledo C， Kuprewicz E K， Staines C L， et al. Limited tolerance by insects to high temperatures across tropical elevational gradients and the implications of global warming for extinction[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2016， 113（1）： 680-685 [5] 馬 罡， 马春森. 气候变化下极端高温对昆虫种群影响的研究进展[J]. 中国科学： 生命科学， 2016， 46（5）： 556-564.
[6] Overgaard J， Kearney M R， Hoffmann A A. Sensitivity to thermal extremes in Australian Drosophila implies similar impacts of climate change on the distribution of widespread and tropical species[J]. Global Change Biol， 2014， 20（6）： 1 738-1 750.
[7] Hill M P， Chown S L， Hoffmann A A. A predicted niche shift corresponds with increased thermal resistance in an invasive mite， Halotydeus destructor[J]. Global Ecol Biogeogr， 2013， 22（8）： 942-951
[8] 李定旭， 张晓宁， 杨玉玲， 等. 高温冲击对山楂叶螨的影响[J]. 生态学报， 2010， 30（16）： 4 437-4 444.
[9] Liu B， Jiang G， Zhang Y， et al. Analysis of transcriptome differences between resistant and susceptible strains of the citrus red mite Panonychus citri （Acari： Tetranychidae） [J]. PLoS ONE， 2016， 6（12）： e28516. doi： 10.1371/journal.pone.0028516.
[10] Pfaffl M W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Res， 2001， 29（9）： e45-e45.
[11] Lu F P， Chen Z S， Chen Q， et al. Effects of heat stress on development， reproduction and activities of protective enzymes in Mononychellus mcgregori[J]. Exp Appl Acarol， 2014， 63（2）： 267-284.
[12] Isbell F， Craven D， Connolly J， et al. Biodiversity increases the resistance of ecosystem productivity to climate extremes[J]. Nature， 2015， 526： 574-577.
[13] Shenker M， Plessner O E， Tel-Or E. Manganese nutrition effects on tomato growth， chlorophyll concentration， and superoxide dismutase activity[J]. J Plant Physiol， 2004， 161： 197-202.
[14] Ke S S. Effects of copper on the photosynthesis and oxidative metabolism of Amaranthus tricolor seedlings[J]. Agr Sci China， 2007， 6（10）： 1 182-1 192.
[15] Gao J J， Li T， Yu X C. Gene expression and activities of SOD in cucumber seedlings were related with concentrations of Mn2+， Cu2+， or Zn2+ under low temperature stress[J]. Agr Sci China， 2009， 8（6）： 678-684.
[16] Barthell J F， Hranitz J M， Thorp R W， et al. High temperature responses in two exotic leafcutting bee species： Megachile apicalis and M. rotundata （Hymenoptera： Megachilidae） [J]. Pan-Pac. Entomol， 2002， 78， 235-246.
[17] Foyer C H， Lopez-Delgado H， Dat J F， et al. Hydrogen peroxide and glutathione-associated mechanisms of acclamatory stress tolerance and signaling[J]. Physiol Plant， 1997， 100（2）： 241-254.
[18] Chown S， Nicolson S W. Insect physiological ecology： mechanisms and patterns[M]. Oxford： Oxford University Press， 2004. [19] 杨丽红. 柑橘全爪螨Panonychus citri （McGregor） 对热胁迫的响应机制研究[D]. 重庆： 西南大学， 2011.
[20] 袁燕萍. 热冲击对家蚕五龄幼虫抗氧化酶的影响[D]. 苏州： 苏州大学， 2011.
[21] Lopez M G， Elnitsky M A， Benoit J B， et al. High resistance to oxidative damage in the Antarctic midge Beigica anlarctica， and developmentally linked expression of genes encoding superoxide dismutase， catalase and heat shock proteins[J]. Insect Biochem Molec， 2008， 38： 796-804.
[22] 尹丽红， 王琛柱， 钦俊德. 棉铃虫齿唇姬蜂对棉铃虫血淋巴酚氧化酶的影响[J]. 科学通报， 2001（15）： 1 303-1 307.
[23] 张小玉， 汪 贞， 黄泽夫， 等. 棉铃虫不同虫态及虫龄血淋巴中酚氧化酶活力的比较[J]. 昆虫知识， 2006（3）： 330-332.
[24] 刘守柱. 昆虫酚氧化酶免疫学功能及其对杀虫剂等外来干扰因子的响应[D]. 泰安： 山东农业大学， 2008.
[25] 徐亚玲， 李文楚. 昆虫酚氧化酶作用机制的研究进展[J]. 安徽农业科学， 2010， 38（27）： 14 844-14 846.
[26] 赵 卓， 李 校， 金 立， 等. 温度对不同发育阶段东亚飞蝗酚氧化酶活性的影响[J]. 吉林农业大学学报， 2011， 33（6）： 613-616.
[27] 刘永春， 张东顺. 三种家蝇酚氧化酶基因表达差异研究[J]. 济宁医学院学报， 2011， 34（1）： 12-14.
[28] 程 鹏， 谭文彬， 代玉华， 等. 酚氧化酶基因在3种淡色库蚊体内表达量比较[J]. 寄生虫病与感染性疾病， 2011， 9（1）： 11-13.
[29] Pauli D， Arrigo A P， Tissières A. Heat shock response in Drosophila[J]. Experientia， 1992， 48： 623-629.
[30] Bettencourt B R， Feder M E. Hsp70 duplication in the Drosophila melanogaster species group： How and when did two become five？[J]. Mol Biol Evol， 2001， 18（7）： 1 272-1 282.
[31] Feder M E， Krebs R A. Ecological and evolutionary physiology of heat-shock proteins and the stress response in： Complementary insights from genetic engineering and natural variation[M]//Bijlsma R.， Loeschcke V.， eds. Environmental Stress， Adaptation and Evolution[M]. Birkhauser Basel， 1997： 155-173.
[32] 崔旭红. B型烟粉虱和温室粉虱热胁迫适应性及其分子生态机制[D]. 北京： 中国农业科学院， 2007.
[33] Stanley S M， Parsons P A， Spence G E. Resistance of species of the Drosophila melanogaster subgroup to environmental extremes[J]. Aust J Zool， 1980， 28（3）： 413-421.
[34] 冯宏祖. 朱砂叶螨适应阿维菌素高温胁迫机制的研究[D]. 重庆： 西南大学， 2009.
[35] 陈 兵， 康 乐. 昆虫对环境温度胁迫的适应与种群分化[J]. 自然科学进展， 2005， 15（3）： 265-271.
[36] Horton D E， Johnson N C， Singh D， et al. Contribution of changes in atmospheric circulation patterns to extreme temperature trends[J]. Nature， 2015， 522（7 557）： 465-469.
[37] Christidis N， Jones G S， Stott P A. Dramatically increasing chance of extremely hot summers since the 2003 European heat wave[J]. Nat Clim Chang， 2015， 5： 46-50.
[38] Sexton D M H， Harris G R. The importance of including variability in climate change projections used for adaptation[J]. Nat Clim Change， 2015， 5： 931-936.
[39] 劉井兰， 于建飞， 吴进才， 等. 昆虫活性氧代谢[J]. 昆虫知识， 2006， 43（6）： 752-756.
关键词 木薯单爪螨；高温；保护酶；热激蛋白；基因表达；酶活性
中图分类号 S533 文献标识码 A
Abstract Cassava green mite Mononychellus mcgregori is a newly invasive pest mite of cassava in China. It was reported the first time in Danzhou， Hainan， China in 2008 and has since become more widespread. The origin of M. mcgregori is South America and as a tropical native mite， the adaptation to high temperature is the significant foundation for its occurrence and damage. The results showed that the relative expression of PPO， POD， AsA-POD， CAT and Cu/Zn SOD genes in M. mcgregori via RTFQ PCR increased in adults after they were exposed to extremely high temperature（42 ℃）for 1 h， which increased 5.19， 4.38， 152.23， 321.42 and 3.41 times over that of the control， respectively， and were in accord with their enzyme activities（1.81， 12.52， 9.00， 1.75 and 1.14 times over that of the control）. And the relative expression of heat shock protein 70（Hsp70）gene increased 56.85 times over that of the control. These results suggested that protective enzymes POD， AsA-POD， CAT and SOD were associate with the thermostability of M. mcgregori and they might have synergistic effects on protect the mite against toxic oxygen intermediates and perhaps were associate with the resistance of high temperature in M. mcgregori. The increasing of PPO gene expression was perhaps associated with the immunity improvement of the mite to high temperature stress. And the elevated expression of Hsp70 gene was perhaps related to the adaptation of M. mcgregori to high temperature. These results provide a theoretical basis and precondition for further research on the molecular mechanisms of the thermostability and ecological adaptability of M. mcgregori.
Key words Mononychellus mcgregori； extreme high temperature； protective enzymes； heat shock protein； gene expression； enzyme activities
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.05.022
木薯单爪螨（Mononychellus mcgregori）原产地为南美洲，是一种热带土著害螨，对高温的适应性是其种群扩散的重要前提。该螨自2008年首次在中国海南发现，目前调查发现，其已在广西、广东、云南等省区广泛分布，且其发生期从入侵之初的仅在冬、春季发生而目前已发展到全年发生为害，已逐渐对中国发生区的气候环境产生适应。近年来该螨亦开始在泰国、柬埔寨和越南在内的亚洲国家木薯种植区扩散为害[1]。研究表明，木薯单爪螨对高温却相對敏感，36 ℃及以上高温胁迫1 h即可影响该螨的发育与繁殖，使其成螨产卵量减少，卵孵化率降低，42 ℃极端高温暴露1 h为木薯单爪螨热最敏感时间[2]。耐热性决定了昆虫的地理分布区域，研究表明，起源于热带及相对较干地区的昆虫种类具有更高的耐热性[3]。极端高温对昆虫种群地理分布、种群统计参数和种群增长、行为及种间关系等均存在显著影响[4-6]。赤足叶螨（Halotydeus destructor）在从南非入侵澳大利亚后，移动温度上限（HMT）和热昏迷温度（HCT）均显著升高，因此导致其在澳大利亚的地理分布范围扩大，并向更低维度地区扩散分布[7]。42 ℃高温处理4～6 h后，山楂叶螨成螨的产卵量和寿命均未受显著影响，39 ℃以上高温冲击会导致山楂叶螨种群数量迅速增加，这是导致山楂叶螨多在中国北方各地高温季节猖獗危害的直接诱因之一[8]。本研究对42 ℃极端高温胁迫1 h后木薯单爪螨各龄螨几种保护酶（PPO、POD、AsA-POD、CAT和SOD）基因表达与活性的差异以及热激蛋白Hsp70基因的表达做了分析，以探讨极端高温对木薯单爪螨的影响机制，为进一步研究其生态适应性及其机制，以及更好地监测其发生与扩散范围奠定基础。 1 材料与方法
1.1 材料
供试木薯单爪螨来源于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所特色热带作物害虫课题组室内木薯叶片继代饲养的实验种群。
1.2 方法
1.2.1 极端高温胁迫试验 将蜕皮12 h以内的木薯单爪螨幼螨、前若螨、后若螨及成螨分别以每叶100头接到清洗干净的新鲜木薯叶片上，置于温度为（42±1）℃，湿度均为75%±5%、光周期12（L） ∶ 12（D）的人工气候箱中，1 h后取出，提取总RNA，每个龄期处理6 000～12 000头。以室温（25±1）℃处理作为对照。
1.2.2 保护酶基因表达量的定量PCR测定 木薯单爪螨总RNA的提取参照Trizol RNA提取试剂盒进行[9]。总RNA经纯化去除基因组DNA，并经过浓度、纯度与完整性检测后，使用TOYOBO反转录试剂盒进行cDNA的合成。cDNA样品经nuclear-free水10倍稀释后作为荧光定量PCR的模板，以β-actin基因为内参基因，相关基因的引物信息见表1。PCR反应在ABI PRISM 7700PCR仪进行，扩增条件见表2。回收扩增基因片段，制作标准曲线和熔解曲线。根据Pfaffl的2-ΔΔCt方法计算42 ℃极端高温胁迫1 h后保护酶PPO、POD、AsA-POD、CAT和SOD基因及热激蛋白Hsp70基因的相对表达量[10]。
1.2.3 保护酶活性测定 保护酶PPO、POD、AsA-POD、CAT和SOD活性测定参照Lu等[11]方法。
1.3 数据处理
检测结果进行标准曲线分析，以对目的基因进行定量，用样品的目的基因测得值除以内参基因测得值以校正误差，所得结果表示目的基因相对含量。在Microsoft Excel中进行相对定量数据统计处理。用SPSS软件duncan’s新复极差法比较分析42 ℃极端高温处理1 h后木薯单爪螨保护酶PPO、POD、AsA-POD、CAT和Cu/Zn SOD基因和热激蛋白Hsp70基因的相对表达量与对照间的比值差异，并比较分析保护酶PPO、POD、AsA-POD、CAT和SOD基因表达与酶活性间的差异。
2 结果与分析
2.1 42 ℃极端高温胁迫1 h对木薯单爪螨保护酶基因相对表达量的影响
2.1.1 42 ℃极端高温胁迫1 h对木薯单爪螨PPO基因相对表达量的影响 经42 ℃极端高温胁迫1 h后，木薯单爪螨前若螨和成螨PPO基因相对表达量显著升高（p<0.05），分别升高为对照的13.88和5.19倍，而幼螨和后若螨PPO基因相对表达量却降低为对照的0.34和0.16倍（图1）。
2.1.2 42 ℃极端高温胁迫1 h对木薯单爪螨POD基因相对表达量的影響 经42 ℃极端高温胁迫1 h后，木薯单爪螨POD基因相对表达量在除前若螨外的其他各龄螨体内显著升高（p<0.05），分别升高为对照的2.41倍（幼螨），2.83倍（后若螨）和4.38倍（成螨）（图2）。而前若螨POD基因的相对表达量却降低为对照的0.37倍。
2.1.3 42 ℃极端高温胁迫1 h对木薯单爪螨AsA-POD基因相对表达量的影响 各龄木薯单爪螨经42 ℃极端高温胁迫1 h后，体内AsA-POD基因相对表达量在幼螨、前若螨和后若螨体内显著降低，而在成螨体内则极显著升高（图3，p<0.01）。其中幼螨、前若螨和后若螨体内AsA-POD基因的相对表达量分别降低为对照的0.25，0.15和0.82倍，而成螨AsA-POD基因的相对表达量却比对照升高152.24倍。
2.1.4 42 ℃极端高温胁迫1 h对木薯单爪螨CAT基因相对表达量的影响 各龄木薯单爪螨经42 ℃极端高温胁迫1 h后，体内CAT基因相对表达量除前若螨显著降低外，其他各龄期均显著升高（图4）。幼螨、后若螨和成螨CAT基因相对表达量分别比对照升高27.27、63.64和321.42倍，而前若螨CAT基因相对表达量却降低为对照的0.40倍。
2.1.5 42 ℃极端高温胁迫1 h对木薯单爪螨Cu/Zn SOD基因相对表达量的影响 各龄木薯单爪螨经42 ℃极端高温胁迫1 h后，体内Cu/Zn SOD基因相对表达量均具有升高趋势（图5），幼螨、前若螨、后若螨和成螨Cu/Zn SOD基因分别升高为对照的1.16、2.98、2.67和3.41倍。
2.2 42 ℃极端高温胁迫1 h后木薯单爪螨保护酶基因表达量与活性比较
42 ℃极端高温胁迫不同发育阶段木薯单爪螨1 h后，其体内保护酶PPO、POD、AsA-POD、CAT和Cu/Zn SOD基因的相对表达量和酶活性发生了显著变化（图6～10）。其中，所有检测保护酶PPO、POD、AsA-POD、CAT和SOD在成螨体内的基因相对表达量和活性均显著升高，与对照相比，其升高倍数分别为5.19倍和1.81倍，4.38倍和12.52倍，152.23和9.00倍，321.42倍和1.75倍，3.41倍和1.14倍，虽然CAT基因的相对表达量极显著升高（图9，p<0.01），且为最高值，但其活性仅升高为对照的1.75倍，而AsA-POD基因相对表达量与酶活性均极显著高于对照（图8）。在幼螨和若螨体内，Cu/Zn SOD基因表达均显著升高（p<0.05），但酶活性却无显著变化（图10）。POD和CAT基因表达在幼螨和后若螨体内显著升高，但其酶活性却仅在幼螨体内显著升高（p<0.05）；而在前若螨体内，POD基因表达降低，活性无显著变化，CAT基因表达和酶活性均显著降低（图7和图9，p<0.05）。PPO基因表达量与酶活性仅在前若螨体内显著升高（图6，p<0.05）。相比之下，AsA-POD基因表达却在幼螨和若螨体内显著降低，酶活性在前若螨和后若螨体内无显著变化，但在幼螨体内显著升高（图8，p<0.05）。说明不同龄期对高温的敏感性与应对机制可能存在不同。 2.3 42 ℃极端高温胁迫1 h对木薯单爪螨Hsp70基因相对表达量的影响
各龄木薯单爪螨经42 ℃极端高温胁迫1 h后，其体内Hsp70基因相对表达量极显著升高（图11，p<0.01），达对照的56.85倍，而幼螨、前若螨和后若螨体内Hsp70基因相对表达量均显著下降，分别降低为对照的0.51、0.11和0.000 64倍。
3 讨论
产生抗氧化反应和诱导热激蛋白基因（HSPs）的表达，是昆虫（螨）抵抗热胁迫的重要生理机制[12]。研究表明，热胁迫会诱导抗氧化酶基因的表达[13-15]。本研究结果显示，42 ℃极端高温胁迫不同发育阶段木薯单爪螨1 h后，其体内保护酶基因PPO、POD、AsA-POD、CAT和Cu/Zn SOD的相对表达量在成螨体内均显著升高，其中最高为CAT基因，相对表达量达对照的321.42倍，其次为AsA-POD基因，达对照的152.23倍，且基因的表达和其活性的升高存在一致性。本研究结果与Barthell等[16]和Foyer等[17]热胁迫会诱导生物体胞质内AsA-POD基因的转录活性，同时导致AsA-POD活性的升高研究发现部分一致。研究表明，在逆境中，AsA-POD的表达量增加，同时，大量AsA-POD的增加可以增加POD活性，从而加强了自由基清除系统，导致生物体对氧化压力的耐受性增强[18]，本研究结果也证实42 ℃极端高温胁迫1 h既增加了木薯单爪螨成螨AsA-POD基因的表达和活性，也增加了POD基因的表达和酶活性，这可能是其响应极端高温胁迫的一种保护机制之一。研究表明，抗氧化酶（SOD、CAT以及POD等）系统在柑橘全爪螨、家蚕及南极蚊等昆虫抵抗热冲击中发挥着重要的作用[19-21]。PPO是昆虫体内重要的免疫蛋白，在昆虫对外界伤害的免疫和防御过程中发挥着重要作用[22-28]。因此，结合42 ℃极端高温胁迫对木薯单爪螨发育和繁殖存在显著影响[11]，保护酶POD、AsA-POD、CAT和SOD基因表达量及其酶活性的升高可能在木薯单爪螨成螨对高温的适应性中发挥了重要的作用。在不利环境条件胁迫下，热激蛋白（Hsp）具有应激保护细胞的作用[29]，Hsp70是热和其他应激所能诱导出的作用最为显著的蛋白质之一[30]。本研究也发现，极端高温胁迫不同发育阶段木薯单爪螨1 h后，成螨体内热激蛋白基因Hsp70的相对表达量显著升高。研究表明，果蝇的幼虫和蛹Hsp70蛋白在太阳光照射后大量表达，这种表达使果蝇可抵抗40 ℃高温[31]。崔旭红[32]研究表明，Hsp70在B型烟粉虱抵抗高温胁迫中发挥了重要作用，对其机制的研究有利于揭示B型烟粉虱及其他入侵害虫的种群形成与扩张机制，对B型烟粉虱的可持续控制具有重要的理论和实践意义。
昆虫对热胁迫的耐受力及对生活环境的极端高温及其临界耐受最高温度决定了其种群的时空分布范围[5，33]。研究表明，朱砂叶螨为适应环境胁迫，尤其是高温等胁迫，发展了其耐胁迫能力，从而增加了其种群对高温的适应能力，增加了种群在高温环境下的适合度[34]。柑橘全爪螨种群的季节动态变化，可能是其对温度变化的一种适应性反应[19]。外来入侵物种对温度胁迫耐受能力的高低对其入侵新环境后的扩散以及种群动态具有重要影响[35]。高温适应性的生理生化及分子机制对揭示外来物种种群扩张、种间替代和种群生态预测均有重要的理论和实践意义[32]。目前，因气候变化所导致的极端高温及其影响问题已备受世界关注[12，36-38]，而作为入侵害螨，木薯单爪螨自近年入侵中国热区后，种群数量在不断增加，扩散速度在不断加快[11]。抗氧化酶和热激蛋白Hsp70基因表达量的升高可能导致成螨对高温的耐受能力逐渐增强，从而增强其后续的繁殖能力而使其种群不断增长，扩张范围不断增强。因此，本研究可为了解木薯单爪螨入侵中国后的生态适应性及其种群扩张机制，进一步探讨木薯单爪螨耐热性的分子机理及其生态适应性机理提供了理论依据和前期工作基础，并為木薯单爪螨的有效防控提供技术支撑。
此外，研究昆虫抗氧化酶抑制剂对克服和延缓害虫害螨抗性有重要的意义，适宜昆虫抗氧化酶抑制剂的研制，将使昆虫或螨类体内抗氧化酶的活性在一定的逆境（如高低温、寄主等）胁迫条件下不发生变化，进而延缓昆虫的抗逆适应性，将对害虫害螨的有效治理产生重要意义[39]。因此，本研究亦可为木薯单爪螨抗热治理提供理论依据。
参考文献
[1] Bellotti A， Vanessa H C， Hyman G. Cassava production and pest management： present and potential threats in a changing environment[J]. Tropical Plant Boil， 2012， 5（1）： 39-72.
[2] 卢芙萍， 符悦冠， 陈 青， 等. 温度对木薯单爪螨生长发育与繁殖的影响[J]. 热带作物学报， 2011， 32（9）： 1 720-1 724.
[3] Kellermann V， Overgaard J， Hoffmann A A， et al. Upper thermal limits of Drosophila are linked to species distributions and strongly constrained phylogenetically[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2012， 109（40）： 16 228-16 233.
[4] Garcia-Robledo C， Kuprewicz E K， Staines C L， et al. Limited tolerance by insects to high temperatures across tropical elevational gradients and the implications of global warming for extinction[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2016， 113（1）： 680-685 [5] 馬 罡， 马春森. 气候变化下极端高温对昆虫种群影响的研究进展[J]. 中国科学： 生命科学， 2016， 46（5）： 556-564.
[6] Overgaard J， Kearney M R， Hoffmann A A. Sensitivity to thermal extremes in Australian Drosophila implies similar impacts of climate change on the distribution of widespread and tropical species[J]. Global Change Biol， 2014， 20（6）： 1 738-1 750.
[7] Hill M P， Chown S L， Hoffmann A A. A predicted niche shift corresponds with increased thermal resistance in an invasive mite， Halotydeus destructor[J]. Global Ecol Biogeogr， 2013， 22（8）： 942-951
[8] 李定旭， 张晓宁， 杨玉玲， 等. 高温冲击对山楂叶螨的影响[J]. 生态学报， 2010， 30（16）： 4 437-4 444.
[9] Liu B， Jiang G， Zhang Y， et al. Analysis of transcriptome differences between resistant and susceptible strains of the citrus red mite Panonychus citri （Acari： Tetranychidae） [J]. PLoS ONE， 2016， 6（12）： e28516. doi： 10.1371/journal.pone.0028516.
[10] Pfaffl M W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Res， 2001， 29（9）： e45-e45.
[11] Lu F P， Chen Z S， Chen Q， et al. Effects of heat stress on development， reproduction and activities of protective enzymes in Mononychellus mcgregori[J]. Exp Appl Acarol， 2014， 63（2）： 267-284.
[12] Isbell F， Craven D， Connolly J， et al. Biodiversity increases the resistance of ecosystem productivity to climate extremes[J]. Nature， 2015， 526： 574-577.
[13] Shenker M， Plessner O E， Tel-Or E. Manganese nutrition effects on tomato growth， chlorophyll concentration， and superoxide dismutase activity[J]. J Plant Physiol， 2004， 161： 197-202.
[14] Ke S S. Effects of copper on the photosynthesis and oxidative metabolism of Amaranthus tricolor seedlings[J]. Agr Sci China， 2007， 6（10）： 1 182-1 192.
[15] Gao J J， Li T， Yu X C. Gene expression and activities of SOD in cucumber seedlings were related with concentrations of Mn2+， Cu2+， or Zn2+ under low temperature stress[J]. Agr Sci China， 2009， 8（6）： 678-684.
[16] Barthell J F， Hranitz J M， Thorp R W， et al. High temperature responses in two exotic leafcutting bee species： Megachile apicalis and M. rotundata （Hymenoptera： Megachilidae） [J]. Pan-Pac. Entomol， 2002， 78， 235-246.
[17] Foyer C H， Lopez-Delgado H， Dat J F， et al. Hydrogen peroxide and glutathione-associated mechanisms of acclamatory stress tolerance and signaling[J]. Physiol Plant， 1997， 100（2）： 241-254.
[18] Chown S， Nicolson S W. Insect physiological ecology： mechanisms and patterns[M]. Oxford： Oxford University Press， 2004. [19] 杨丽红. 柑橘全爪螨Panonychus citri （McGregor） 对热胁迫的响应机制研究[D]. 重庆： 西南大学， 2011.
[20] 袁燕萍. 热冲击对家蚕五龄幼虫抗氧化酶的影响[D]. 苏州： 苏州大学， 2011.
[21] Lopez M G， Elnitsky M A， Benoit J B， et al. High resistance to oxidative damage in the Antarctic midge Beigica anlarctica， and developmentally linked expression of genes encoding superoxide dismutase， catalase and heat shock proteins[J]. Insect Biochem Molec， 2008， 38： 796-804.
[22] 尹丽红， 王琛柱， 钦俊德. 棉铃虫齿唇姬蜂对棉铃虫血淋巴酚氧化酶的影响[J]. 科学通报， 2001（15）： 1 303-1 307.
[23] 张小玉， 汪 贞， 黄泽夫， 等. 棉铃虫不同虫态及虫龄血淋巴中酚氧化酶活力的比较[J]. 昆虫知识， 2006（3）： 330-332.
[24] 刘守柱. 昆虫酚氧化酶免疫学功能及其对杀虫剂等外来干扰因子的响应[D]. 泰安： 山东农业大学， 2008.
[25] 徐亚玲， 李文楚. 昆虫酚氧化酶作用机制的研究进展[J]. 安徽农业科学， 2010， 38（27）： 14 844-14 846.
[26] 赵 卓， 李 校， 金 立， 等. 温度对不同发育阶段东亚飞蝗酚氧化酶活性的影响[J]. 吉林农业大学学报， 2011， 33（6）： 613-616.
[27] 刘永春， 张东顺. 三种家蝇酚氧化酶基因表达差异研究[J]. 济宁医学院学报， 2011， 34（1）： 12-14.
[28] 程 鹏， 谭文彬， 代玉华， 等. 酚氧化酶基因在3种淡色库蚊体内表达量比较[J]. 寄生虫病与感染性疾病， 2011， 9（1）： 11-13.
[29] Pauli D， Arrigo A P， Tissières A. Heat shock response in Drosophila[J]. Experientia， 1992， 48： 623-629.
[30] Bettencourt B R， Feder M E. Hsp70 duplication in the Drosophila melanogaster species group： How and when did two become five？[J]. Mol Biol Evol， 2001， 18（7）： 1 272-1 282.
[31] Feder M E， Krebs R A. Ecological and evolutionary physiology of heat-shock proteins and the stress response in： Complementary insights from genetic engineering and natural variation[M]//Bijlsma R.， Loeschcke V.， eds. Environmental Stress， Adaptation and Evolution[M]. Birkhauser Basel， 1997： 155-173.
[32] 崔旭红. B型烟粉虱和温室粉虱热胁迫适应性及其分子生态机制[D]. 北京： 中国农业科学院， 2007.
[33] Stanley S M， Parsons P A， Spence G E. Resistance of species of the Drosophila melanogaster subgroup to environmental extremes[J]. Aust J Zool， 1980， 28（3）： 413-421.
[34] 冯宏祖. 朱砂叶螨适应阿维菌素高温胁迫机制的研究[D]. 重庆： 西南大学， 2009.
[35] 陈 兵， 康 乐. 昆虫对环境温度胁迫的适应与种群分化[J]. 自然科学进展， 2005， 15（3）： 265-271.
[36] Horton D E， Johnson N C， Singh D， et al. Contribution of changes in atmospheric circulation patterns to extreme temperature trends[J]. Nature， 2015， 522（7 557）： 465-469.
[37] Christidis N， Jones G S， Stott P A. Dramatically increasing chance of extremely hot summers since the 2003 European heat wave[J]. Nat Clim Chang， 2015， 5： 46-50.
[38] Sexton D M H， Harris G R. The importance of including variability in climate change projections used for adaptation[J]. Nat Clim Change， 2015， 5： 931-936.
[39] 劉井兰， 于建飞， 吴进才， 等. 昆虫活性氧代谢[J]. 昆虫知识， 2006， 43（6）： 752-756.