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【中图分类号】R72 【文献标识码】B 【文章编号】1004-7484（2013）03-0017-02
支气管哮喘（简称哮喘）是一种严重危害人类尤其是儿童健康的肺部慢性炎症反应性疾病，其作用机制主要是以嗜酸粒细胞、淋巴细胞和肥大细胞等浸润为主的气道慢性变态反应性炎症，其中T淋巴细胞在哮喘的发病机制中起着尤为重要的作用[1]。研究表明，IL-4和IL-13信号转导系统在哮喘发病机制中起重要作用。在非造血的固有气道组织通过IL-4、IL-13受体的信号转导是过敏性气道炎症的主要机制[2，3]。
天然维生素E，是色满（苯并二氢呋喃）的衍生物，因其重要的抗氧化功能，作为抗氧化剂已被广泛用于食品及美容品等生活用品中，且已证实无论在营养、生理活性还是在安全性上均优于合成的维生素E[4]。γ-维生素E（γ-VE）为天然维生素E，具有许多重要的生物学活性，除了促进生殖，维持中枢神经系统、心血管系统等功能外还具有免疫调节作用，且γ-VE缺乏与人肺上皮细胞IL-13和IL-4的表达有关[5]。Navarro等[6]研究显示哮喘患者体内免疫失调与Th1类细胞因子分泌不足，Th2类细胞因子产生增加，进而导致免疫球蛋白E（IgE）合成增加有关。因此，本研究采用吸入卵蛋白（OVA）致敏的方法制备小鼠哮喘模型，用γ-VE进行干预，用ELISA检测小鼠血清和肺泡灌洗液IL-13和IL-4水平，以及血清中IgE含量的变化，探讨天然维生素E对哮喘小鼠细胞因子及免疫球蛋白E的影响，为哮喘的治疗提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
SPF级雌性Balb/c小鼠30只，体重18～20g，由中国医科大学动物部提供。随机分为Ⅰ组：哮喘组、Ⅱ组：γ-VE干预组、Ⅲ组：对照组，每组10只小鼠。
1.2 方法
1.2.1 哮喘模型的制备
采用吸入OVA（美国Sigma）致敏法制备哮喘模型。Ⅰ组分别于第0、7、14天腹腔注射0.5mL致敏液（含OVA 10 μg和氢氧化铝凝胶2 mg）致敏；第2l天将小鼠置于密闭箱中，雾化吸入25 g/L的OVA溶液30 min，其中第21～27天每日雾化1次，第28～77天隔天雾化1次，共进行8周；Ⅱ组以上述同样的方法用OVA致敏和激发小鼠，并在每次激发前1 h口服2.5mgγ-VE口服；Ⅲ组用等量生理盐水代替OVA进行腹腔注射和雾化吸入。
1.2.2 样品采集与检测
最后1次雾化吸入OVA 或生理盐水后24h，小鼠眼球放血，分离血清；用磷酸盐平衡溶液（PBS）灌洗双肺3次，收集支气管肺泡灌洗液（BALF），离心去沉淀后置-80℃低温冰箱保存备用；其沉淀行瑞士染色，显微镜下按细胞形态做细胞总数、嗜酸粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞分类计数。
1.2.3 细胞因子检测
用ELISA检测试剂盒（美国R&D）对上述血清及BALF 中IL-13和IL-4进行检测，具体步骤按说明书进行，显色后用ELX808酶标仪（德国BIO-TEK）进行分析，绘制标准曲线，计算IL-13和IL-4含量。
1.2.4 血清IgE水平检测
用ELISA试剂盒（美国R&D）对各组血清中IgE含量进行检测，具体步骤按说明书进行。
1.3 统计学处理
应用SPSS19.0软件进行统计分析，数据以 （±s）表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 小鼠一般情况
Ⅰ组小鼠经OVA刺激后，表现精神沉郁、打喷嚏、鼻部痉痒等哮喘相关表现；而小鼠经γ-VE干预后，各喘息症状明显减轻。
2.2 小鼠BALF中细胞总数及细胞分类
用显微镜对BALF中各类细胞进行计数观察，结果如表1所示：与对照组相比，Ⅰ组小鼠BALF中细胞总数、淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及嗜酸粒细胞数量均明显增加（P<0.05）；Ⅱ组细胞数除巨噬细胞外均与Ⅲ组有显著性差异，但各类细胞数及细胞总数均明显少于哮喘组（P<0.05）。
2.3 细胞因子检测
各组血清及BALF 中细胞因子检测结果如表2所示：与Ⅲ组相比，Ⅰ组这两种细胞因子的表达量均明显升高（P<0.05），而Ⅱ组中IL-4 和 IL-13 水平明显下降（P<0.05），与正常组和哮喘组均有统计学意义（P<0.05）。
2.4 血清IgE水平
哮喘组小鼠血清IgE含量为（668.18±50.17 ng/ml），与正常组（118.81±28.12 ng/ml）相比明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；γ-VE组小鼠血清IgE含量为（220.98±47.78）与哮喘组相比差异有统计学意义（P<0.05），但与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。
图1 各组小鼠血清IgE含量
3 讨 论
天然维生素E，是色满的衍生物，分为生育酚和生育三烯酚两类；有8种类型，即α、β、γ、δ一生育酚和α、β、γ、δ一生育三烯酚，活性各异，其中天然α一生育酚活性最高[7]。研究表明天然维生素E无论在营养、生理活性还是在安全性上均优于合成的维生素E[8]。本研究采用的γ-VE属天然维生素E，具有促进生殖、维持中枢神经系统、心血管系统及免疫调节作用。研究人员在5年内对2000名孕妇及其婴儿进行了跟踪调查，结果显示维生素E有助于胎儿肺部的发育，而且在怀孕16周以前为最关键的阶段[9]。本实验结果显示，小鼠经OVA刺激后出现鼻部痉痒、打喷嚏和抓耳等哮喘表现，而经γ-VE干预后，小鼠哮喘临床表现明显减轻。提示γ-VE有助于哮喘治疗。
TOM等证实IL-4、IL-13及其受体复合物共同亚单位在调节过敏性感染和气道组织重建的信号通路中发挥重要作用[10]。本研究结果显示哮喘组两种细胞因子的表达量均明显升高，而γ-VE组中IL-4 和 IL-13 水平明显下降，提示γ-VE在哮喘发生中起一定调节作用。Geba等[11]对反复呼吸道感染患儿补充高于推荐摄入量的维生素E后其免疫水平有所提高，且大多学者认为给予较高剂量的天然维生素E是安全的。
血清中IgE主要作用于肥大细胞，若IgE含量增加，其升高的部分会促使肥大细胞释放大量炎性介质，并参与哮喘气道炎症的形成。研究表明，血清IgE浓度与哮喘的发病概率或严重程度成正比[12]。本研究发现哮喘组IgE含量最高，而经γ-VE组干预后其水平降低，提示γ-VE在哮喘发生中起一定免疫调节作用。
综上，本研究采用吸入OVA致敏法制作小鼠哮喘模型，模型良好；经γ-VE干预后，小鼠哮喘表现减轻；各类炎性细胞数均减少；IL-4、IL-13和IgE水平明显降低。由此可见，天然维生素E与哮喘发生中的细胞因子和免疫应答有关，该研究为支气管哮喘的临床治疗提供新思路，为其药物研发奠定基础。
支气管哮喘（简称哮喘）是一种严重危害人类尤其是儿童健康的肺部慢性炎症反应性疾病，其作用机制主要是以嗜酸粒细胞、淋巴细胞和肥大细胞等浸润为主的气道慢性变态反应性炎症，其中T淋巴细胞在哮喘的发病机制中起着尤为重要的作用[1]。研究表明，IL-4和IL-13信号转导系统在哮喘发病机制中起重要作用。在非造血的固有气道组织通过IL-4、IL-13受体的信号转导是过敏性气道炎症的主要机制[2，3]。
天然维生素E，是色满（苯并二氢呋喃）的衍生物，因其重要的抗氧化功能，作为抗氧化剂已被广泛用于食品及美容品等生活用品中，且已证实无论在营养、生理活性还是在安全性上均优于合成的维生素E[4]。γ-维生素E（γ-VE）为天然维生素E，具有许多重要的生物学活性，除了促进生殖，维持中枢神经系统、心血管系统等功能外还具有免疫调节作用，且γ-VE缺乏与人肺上皮细胞IL-13和IL-4的表达有关[5]。Navarro等[6]研究显示哮喘患者体内免疫失调与Th1类细胞因子分泌不足，Th2类细胞因子产生增加，进而导致免疫球蛋白E（IgE）合成增加有关。因此，本研究采用吸入卵蛋白（OVA）致敏的方法制备小鼠哮喘模型，用γ-VE进行干预，用ELISA检测小鼠血清和肺泡灌洗液IL-13和IL-4水平，以及血清中IgE含量的变化，探讨天然维生素E对哮喘小鼠细胞因子及免疫球蛋白E的影响，为哮喘的治疗提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
SPF级雌性Balb/c小鼠30只，体重18～20g，由中国医科大学动物部提供。随机分为Ⅰ组：哮喘组、Ⅱ组：γ-VE干预组、Ⅲ组：对照组，每组10只小鼠。
1.2 方法
1.2.1 哮喘模型的制备
采用吸入OVA（美国Sigma）致敏法制备哮喘模型。Ⅰ组分别于第0、7、14天腹腔注射0.5mL致敏液（含OVA 10 μg和氢氧化铝凝胶2 mg）致敏；第2l天将小鼠置于密闭箱中，雾化吸入25 g/L的OVA溶液30 min，其中第21～27天每日雾化1次，第28～77天隔天雾化1次，共进行8周；Ⅱ组以上述同样的方法用OVA致敏和激发小鼠，并在每次激发前1 h口服2.5mgγ-VE口服；Ⅲ组用等量生理盐水代替OVA进行腹腔注射和雾化吸入。
1.2.2 样品采集与检测
最后1次雾化吸入OVA 或生理盐水后24h，小鼠眼球放血，分离血清；用磷酸盐平衡溶液（PBS）灌洗双肺3次，收集支气管肺泡灌洗液（BALF），离心去沉淀后置-80℃低温冰箱保存备用；其沉淀行瑞士染色，显微镜下按细胞形态做细胞总数、嗜酸粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞分类计数。
1.2.3 细胞因子检测
用ELISA检测试剂盒（美国R&D）对上述血清及BALF 中IL-13和IL-4进行检测，具体步骤按说明书进行，显色后用ELX808酶标仪（德国BIO-TEK）进行分析，绘制标准曲线，计算IL-13和IL-4含量。
1.2.4 血清IgE水平检测
用ELISA试剂盒（美国R&D）对各组血清中IgE含量进行检测，具体步骤按说明书进行。
1.3 统计学处理
应用SPSS19.0软件进行统计分析，数据以 （±s）表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 小鼠一般情况
Ⅰ组小鼠经OVA刺激后，表现精神沉郁、打喷嚏、鼻部痉痒等哮喘相关表现；而小鼠经γ-VE干预后，各喘息症状明显减轻。
2.2 小鼠BALF中细胞总数及细胞分类
用显微镜对BALF中各类细胞进行计数观察，结果如表1所示：与对照组相比，Ⅰ组小鼠BALF中细胞总数、淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及嗜酸粒细胞数量均明显增加（P<0.05）；Ⅱ组细胞数除巨噬细胞外均与Ⅲ组有显著性差异，但各类细胞数及细胞总数均明显少于哮喘组（P<0.05）。
2.3 细胞因子检测
各组血清及BALF 中细胞因子检测结果如表2所示：与Ⅲ组相比，Ⅰ组这两种细胞因子的表达量均明显升高（P<0.05），而Ⅱ组中IL-4 和 IL-13 水平明显下降（P<0.05），与正常组和哮喘组均有统计学意义（P<0.05）。
2.4 血清IgE水平
哮喘组小鼠血清IgE含量为（668.18±50.17 ng/ml），与正常组（118.81±28.12 ng/ml）相比明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；γ-VE组小鼠血清IgE含量为（220.98±47.78）与哮喘组相比差异有统计学意义（P<0.05），但与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。
图1 各组小鼠血清IgE含量
3 讨 论
天然维生素E，是色满的衍生物，分为生育酚和生育三烯酚两类；有8种类型，即α、β、γ、δ一生育酚和α、β、γ、δ一生育三烯酚，活性各异，其中天然α一生育酚活性最高[7]。研究表明天然维生素E无论在营养、生理活性还是在安全性上均优于合成的维生素E[8]。本研究采用的γ-VE属天然维生素E，具有促进生殖、维持中枢神经系统、心血管系统及免疫调节作用。研究人员在5年内对2000名孕妇及其婴儿进行了跟踪调查，结果显示维生素E有助于胎儿肺部的发育，而且在怀孕16周以前为最关键的阶段[9]。本实验结果显示，小鼠经OVA刺激后出现鼻部痉痒、打喷嚏和抓耳等哮喘表现，而经γ-VE干预后，小鼠哮喘临床表现明显减轻。提示γ-VE有助于哮喘治疗。
TOM等证实IL-4、IL-13及其受体复合物共同亚单位在调节过敏性感染和气道组织重建的信号通路中发挥重要作用[10]。本研究结果显示哮喘组两种细胞因子的表达量均明显升高，而γ-VE组中IL-4 和 IL-13 水平明显下降，提示γ-VE在哮喘发生中起一定调节作用。Geba等[11]对反复呼吸道感染患儿补充高于推荐摄入量的维生素E后其免疫水平有所提高，且大多学者认为给予较高剂量的天然维生素E是安全的。
血清中IgE主要作用于肥大细胞，若IgE含量增加，其升高的部分会促使肥大细胞释放大量炎性介质，并参与哮喘气道炎症的形成。研究表明，血清IgE浓度与哮喘的发病概率或严重程度成正比[12]。本研究发现哮喘组IgE含量最高，而经γ-VE组干预后其水平降低，提示γ-VE在哮喘发生中起一定免疫调节作用。
综上，本研究采用吸入OVA致敏法制作小鼠哮喘模型，模型良好；经γ-VE干预后，小鼠哮喘表现减轻；各类炎性细胞数均减少；IL-4、IL-13和IgE水平明显降低。由此可见，天然维生素E与哮喘发生中的细胞因子和免疫应答有关，该研究为支气管哮喘的临床治疗提供新思路，为其药物研发奠定基础。