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目前，我们开展半封闭式立体栽培系统相关研究，以期实现叶菜规模化生产，不仅可以满足市场对高品质蔬菜的需求，还可以创造良好的经济和社会效益。但是目前蔬菜的种植，为了追求产量而过度施用的化肥（无机养分）对土壤环境造成了无法挽回的伤害。无机养分有机化技术的应用，可以在提升蔬菜品质的同时减少对土壤环境的污染。因此，全面解决蔬菜工厂化中遇到的生产难题，提高蔬菜产量和品质，建立半封闭式立体多层栽培系统和无机养分有机化技术种植模式，可使蔬菜淡季不淡，因市场需要随时调节，有计划地生产，有计划地上市，为蔬菜的工业化、商品化、标准化实施，提供稳定而可靠的新型种植模式。为生产无公害绿色蔬菜提供一种最安全有效的方法，为环境恶劣地区的农业发展之路提供重要参考。
1实验步骤
1.1土壤微生物的采集及筛选
本实验从长期施用有机肥的农田进行土壤样品采集，无菌条件下，在TSA培养基上进行土壤微生物筛选，菌种进行10代以上的继代培养后，选择生产代谢产物能力强、繁殖速度快的菌株进行继续继代培养，筛选土壤中主要功能菌株。筛选了代谢较强的土壤微生物20株，采用序列扩增测序和构建系统进化树，了解菌株类别，通过革兰氏染色鉴定9种菌株性质，结合菌株鉴定结果构建一组高效转化无机养分有机菌系。
1.2无机养分有机化体系的建立
对确定的9种菌株进行进一步研究，为了确定每种土壤微生物最佳发酵条件，为后续研究提供数据基础，分别测定了菌株的最佳培养时间、发酵的最佳温度、pH等生化特征，最终对菌株的最佳发酵培养基及培养条件进行了优化。
1.3无机养分有机化栽培方案
将筛选的土壤微生物根据各自的特点发酵为相应的微生物有机肥，然后以生菜为试材，针对生菜各个时期的需求养分状态，有针对性的制定含微生物发酵液的培养基质，以化学培养基质作为对照，综合生菜的形态指标（株高、叶片颜色、叶片数、叶面积）、生理指标（产量、相对含水量、叶绿素含量）和营养品质（维生素C含量、亚硝酸盐含量、抗氧化物活性、抗氧化酶活性）等指标制定适合生菜生长的最佳养分。
1.4 LED最佳光源指标的筛选
设置LED光源波长组合变量、红蓝光比例变量、光强和照度组合变量及光照时间变量等一系列实验，选择自然光条件下栽培的生菜作为对照，测量生菜形态指标、生理指标、营养品质指标的数据，确定在半封闭式叶菜立体多层栽培系统中，最适合蔬菜生长的光源指标数据。
1.5半封闭叶菜立体多层栽培方案
根据以上获得的数據，进行养分供应、循环技术研究、LED灯源调试，确定了适宜半封闭叶菜立体多层栽培系统的最佳栽培模式，为植物工厂一年四季生产优质蔬菜提供技术支持。
2材料与方法
2.1育苗营养液所需分解几丁质微生物的分离驯化研究
2.1.1微生物的采集：选取长期施用有机肥的农田土壤，采集的土壤放入密封袋中，封口置于4℃的冰箱中保存。
2.1.2微生物的筛选：在无菌操作条件下，取1g土样，用无菌水以10倍梯度稀释成10-3-10-6稀释液，取100μl稀释液涂布于以几丁质为碳源的TSA培养基（胰蛋白胨1.5g，大豆蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，pH值7.2，2.5%胶体几丁质40ml，蒸馏水60ml，琼脂2g）平板上，28℃倒置培养。待长出菌落后，选择密度大且生长速度快的微生物进行生产栽培试验。
2.1.3微生物的纯化：将已选定的微生物菌种进行10代以上的继代培养，选择生产代谢产物能力强的培养物继续继代培养。经半年以上连续继代培养，选择仍保持高活性的培养物，进行保存和性质研究。
2.1.4菌株的鉴定：将菌株接种在装有LB液体培养基的250ml三角瓶中，28℃震荡培养5天。取菌体的培养物放入4%戊二醛固定8-10小时，随后分别用50%、75%、90%、100%酒精梯度脱水，用二甲胂酸缓冲液清洗3次，待真空冷冻干燥后，将完全干燥的样品离子溅射喷金，用扫描电镜观察。
2.2无机养分有机化实验
2.2.1最佳发酵条件的确定
2.2.1.1最佳培养时间的确定：挑取菌株单菌落，在180rpm振荡培养，每隔一定时间取发酵液，测420nm处的酶活性，确定最佳培养时间。
2.2.1.2最佳培养温度的确定：在每个菌株的最佳培养时间下，置于盛有50mlLB液体培养基的三角瓶中，在10-50℃培养（180rpm），取发酵液，测420nm处的酶活性，确定最佳培养温度。
2.2.1.3氮源单因子实验：分别以质量分数为1%的酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵、硫酸钠作为氮源制作培养基。
2.2.1.4最佳pH值的确定：按最佳培养温度、时间，分别利用1M乙酸钠（pH5-6），三羟甲基氨基甲烷一盐酸（Tris-HCl）（pH7-8）和碳酸氢钠（pH9-10）等不同的缓冲液，测定最佳粗酶液的酶活力。将复合微生物制剂以色氨酸为碳源，综合上述实验结果，确定最佳发酵条件。
2.2.2生菜幼苗的培育：将草炭土与蛭石按2：1混合均匀，置于营养钵内，将生菜籽种于营养钵内，放置在通风阴暗处至种子发芽。待长出3片叶子时，将其定植在育苗盘孔穴内，保证根部可以接触到液体培养基质。
2.2.3培养基质比较实验：针对生菜生长各个时期养分的状态，制定含微生物发酵液的培养基质。以化学培养基质（ca（N03）24H20945mg/L、KN03809mg/L、NH4H2P04153mg/L、MgS047H20493mg/L Na2Fe-EDTA20mg/L、H3BO32.86mg/L、MnS04·4H20 2.13mg/L、ZnS04·7H2O 0.2mg/L、CuS04·5H20 0.08mg/L、（NH4）6M07024·4H200.02mg/L）为对照，在生菜幼苗定植后的10d、15d、20d、25d分别对各处理进行取样，进行形态指标和生理指标及营养品质指标的测定。叶绿素测量方法：取植株体上部叶片擦净组织表面污物剪碎后称取剪碎的叶片100mg放入盛有10mL DMSO（Dimethyl Sulphoxide）的试管中。静置30分钟于65℃水浴箱中，直至叶片完全变白。把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以DMSO叶绿素提取液为空白，在波长663nm和645nm下用分光光度计测定吸收光度。 计算公式：总叶绿素（g L-1）=0.0202*Abs645+0.0082*Abs663
通过对各处理各项指标的比较，最终确定最适宜叶菜生长的养分供给方案。
2.3半封闭式立体多层栽培系统内叶菜类的栽培技术构建
对半封闭式叶菜立体多层栽培系统进行养分供应、循环技术及最佳层间高度等方面的调试，确定最佳的半封闭式叶菜立体多层栽培系统栽培模式，通过技术集成，构筑低投入、高效率的植物工厂。
3结果与分析
3.1土壤微生物的采集及筛选
本实验为筛选活性较强的土壤微生物，利用分子生物学技术克隆菌种序列，测序后经过序列分析，鉴定菌种名称并分类，最后通过革兰氏染色了解菌种类别。
3.2无机养分有机化栽培筛选
3.2.1发酵菌种的筛选：将筛选的菌液根据最佳发酵条件，发酵为有机养分供给植物工厂内不同生长时期的生菜，将化学营养液作为对照。实验结果如表1所示，有的菌种发酵后所含养分能提供不同生长时期生菜的养分需求，其中6号菌种培养的生菜在叶长、叶宽、叶面积、叶绿素、根长等方面都起到促进作用，而其它菌培育的生菜与对照相比均有不同的下降趋势。因此，根据表1的数据分析，虽然各处理问未见显著差异，但6号菌在叶面积一项中与其它菌存在显著差异，综合生物酶鉴定结果，我们最终决定选择6号菌进行下一步的发酵原料实验。
3.2.2发酵原料的筛选：在本实验中，我们选择糖蜜为基本发酵原料，6号菌为发酵液，在外部环境相同的条件下，分别验证化肥、猪粪发酵后制成有机养分对盆栽生菜生长影响。如表2所示，糖蜜、化肥和猪粪混合及糖蜜、化肥混合的两种发酵液浇灌的生菜，在形态指标和生理指标均表现出明显趋势，比糖蜜单独浇灌的长势好，三种发酵液中，糖蜜、化肥和猪粪混合的营养液培育的生菜，在鲜重及根长方面均显著增加，说明用糖蜜、化肥和猪粪混合的发酵液可持续供应生菜养分需求，适合作为蔬菜生长期的肥料，这为下一步植物工厂发酵液的配置提供了参考。
3.3不同LED光源指标筛选：根据相关文献的查阅，植物对红光有效吸收波长范围为600-680nm之间，对蓝光的有效吸收波长为400-460nm之间，因此，为了筛选植物生长的最佳光源指标，本研究分别设置了上海系统LED、光机所LED、雷士日光灯、上海混合LED等五种不同光质的光照，将自然光作为对照，实验结果如表3，根据表3我们发现，并非所有的人工光源都能改善植物的品质，如光机所LED、雷士日光灯和上海混合LED培养的生菜在叶长、叶宽、叶面积等形态指标都有下降趋势，生菜的外观长势不如自然光条件下生长的好，在营养品质和生物量等方面也显著降低。因此，这三种光源不适合在植物工厂内应用。使用雷士日光灯的生菜在叶绿素积累方面的能力明显弱于使用LED光源的生菜，這也证实了LED系统确实有提高植物营养价值方面的能力，上海系统LED无土栽培的生菜的形态指标、营养品质和生物量显著增加，说明上海LED灯光指标比较适合植物的生长，表明适宜植物生长的红蓝白光比例为11：3：4。
3.4立体多层栽培系统的建立
3.4.1不同栽培模式的比较：植物工厂内，比较常见的栽培模式为雾培、水培和滴溅三种方式，本实验以植物工厂内生菜为试材，比较三种栽培模式下生菜的长势表现，为植物工厂标准化生产提供依据。如表4所示，在不同模式下栽培，生菜的表现各不相同，说明不同的栽培方式对植株生长影响较大，只有选择正确培养方式，才能获得高产。通过三种不同设施栽培方式对比我们发现，用雾培方式培养的生菜在植株长势（叶片数、叶长、叶宽、叶面积）、营养品质（叶绿素）及生物量（鲜重、根长）均优于水培和滴溅。
3.4.2不同营养液对生菜生长的影响：本实验利用有机营养液进行生菜培育，结果表明，施用有机营养液配方标准浓度与施用化学营养液相比，生菜植株生长发育较好，如表5所示，植株在形态、光合特性及产量上均有所提高，叶绿素和鲜重分别增长了17.83%和17.80%，并且有机养分培育的生菜根系明显化学营养液培育的根系粗壮，根长显著大于化学培养的生菜，说明有机养分对生菜根系生长有促进作用。
小结：
1.本实验分离了土壤微生物20种，继代培养后，选择代谢能力较强的微生物菌种9种，分别测定了9种菌的最佳发酵条件；将微生物菌种发酵后，为生菜生长发育的不同时期供应养分，通过对生菜的形态指标、生理指标和营养指标的影响，确定了适宜叶菜生长最佳养分；筛选了不同光源条件，通过光强、照度等的调控增加光合产物的形成，解决了光合作用达不到最优化生长的问题。
2.在半封闭式立体多层栽培系统内有效利用微生物筛选、驯化、发酵工艺研究，将无机养分有机化后供植物体利用，降低了叶菜内亚硝酸盐含量，提高了叶菜的抗氧化活性及维生素含量等，从而提高了叶菜的品质和口感。提高了单位面积内叶菜的产量，且不受季节制约。
3.针对生菜生产我们得出适合植物工厂高效生产的栽培体系如下：①在筛选的众多土壤菌种中，6号菌可作为无机养分转化有机养分的最佳菌种。②栽培方式选择雾培方式较佳。③使用糖蜜、化肥和猪粪共同发酵的有机养分生产的生菜产量较高。④利用LED人工补光的红、蓝、白光的最佳比例为11：3：4。
1实验步骤
1.1土壤微生物的采集及筛选
本实验从长期施用有机肥的农田进行土壤样品采集，无菌条件下，在TSA培养基上进行土壤微生物筛选，菌种进行10代以上的继代培养后，选择生产代谢产物能力强、繁殖速度快的菌株进行继续继代培养，筛选土壤中主要功能菌株。筛选了代谢较强的土壤微生物20株，采用序列扩增测序和构建系统进化树，了解菌株类别，通过革兰氏染色鉴定9种菌株性质，结合菌株鉴定结果构建一组高效转化无机养分有机菌系。
1.2无机养分有机化体系的建立
对确定的9种菌株进行进一步研究，为了确定每种土壤微生物最佳发酵条件，为后续研究提供数据基础，分别测定了菌株的最佳培养时间、发酵的最佳温度、pH等生化特征，最终对菌株的最佳发酵培养基及培养条件进行了优化。
1.3无机养分有机化栽培方案
将筛选的土壤微生物根据各自的特点发酵为相应的微生物有机肥，然后以生菜为试材，针对生菜各个时期的需求养分状态，有针对性的制定含微生物发酵液的培养基质，以化学培养基质作为对照，综合生菜的形态指标（株高、叶片颜色、叶片数、叶面积）、生理指标（产量、相对含水量、叶绿素含量）和营养品质（维生素C含量、亚硝酸盐含量、抗氧化物活性、抗氧化酶活性）等指标制定适合生菜生长的最佳养分。
1.4 LED最佳光源指标的筛选
设置LED光源波长组合变量、红蓝光比例变量、光强和照度组合变量及光照时间变量等一系列实验，选择自然光条件下栽培的生菜作为对照，测量生菜形态指标、生理指标、营养品质指标的数据，确定在半封闭式叶菜立体多层栽培系统中，最适合蔬菜生长的光源指标数据。
1.5半封闭叶菜立体多层栽培方案
根据以上获得的数據，进行养分供应、循环技术研究、LED灯源调试，确定了适宜半封闭叶菜立体多层栽培系统的最佳栽培模式，为植物工厂一年四季生产优质蔬菜提供技术支持。
2材料与方法
2.1育苗营养液所需分解几丁质微生物的分离驯化研究
2.1.1微生物的采集：选取长期施用有机肥的农田土壤，采集的土壤放入密封袋中，封口置于4℃的冰箱中保存。
2.1.2微生物的筛选：在无菌操作条件下，取1g土样，用无菌水以10倍梯度稀释成10-3-10-6稀释液，取100μl稀释液涂布于以几丁质为碳源的TSA培养基（胰蛋白胨1.5g，大豆蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，pH值7.2，2.5%胶体几丁质40ml，蒸馏水60ml，琼脂2g）平板上，28℃倒置培养。待长出菌落后，选择密度大且生长速度快的微生物进行生产栽培试验。
2.1.3微生物的纯化：将已选定的微生物菌种进行10代以上的继代培养，选择生产代谢产物能力强的培养物继续继代培养。经半年以上连续继代培养，选择仍保持高活性的培养物，进行保存和性质研究。
2.1.4菌株的鉴定：将菌株接种在装有LB液体培养基的250ml三角瓶中，28℃震荡培养5天。取菌体的培养物放入4%戊二醛固定8-10小时，随后分别用50%、75%、90%、100%酒精梯度脱水，用二甲胂酸缓冲液清洗3次，待真空冷冻干燥后，将完全干燥的样品离子溅射喷金，用扫描电镜观察。
2.2无机养分有机化实验
2.2.1最佳发酵条件的确定
2.2.1.1最佳培养时间的确定：挑取菌株单菌落，在180rpm振荡培养，每隔一定时间取发酵液，测420nm处的酶活性，确定最佳培养时间。
2.2.1.2最佳培养温度的确定：在每个菌株的最佳培养时间下，置于盛有50mlLB液体培养基的三角瓶中，在10-50℃培养（180rpm），取发酵液，测420nm处的酶活性，确定最佳培养温度。
2.2.1.3氮源单因子实验：分别以质量分数为1%的酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵、硫酸钠作为氮源制作培养基。
2.2.1.4最佳pH值的确定：按最佳培养温度、时间，分别利用1M乙酸钠（pH5-6），三羟甲基氨基甲烷一盐酸（Tris-HCl）（pH7-8）和碳酸氢钠（pH9-10）等不同的缓冲液，测定最佳粗酶液的酶活力。将复合微生物制剂以色氨酸为碳源，综合上述实验结果，确定最佳发酵条件。
2.2.2生菜幼苗的培育：将草炭土与蛭石按2：1混合均匀，置于营养钵内，将生菜籽种于营养钵内，放置在通风阴暗处至种子发芽。待长出3片叶子时，将其定植在育苗盘孔穴内，保证根部可以接触到液体培养基质。
2.2.3培养基质比较实验：针对生菜生长各个时期养分的状态，制定含微生物发酵液的培养基质。以化学培养基质（ca（N03）24H20945mg/L、KN03809mg/L、NH4H2P04153mg/L、MgS047H20493mg/L Na2Fe-EDTA20mg/L、H3BO32.86mg/L、MnS04·4H20 2.13mg/L、ZnS04·7H2O 0.2mg/L、CuS04·5H20 0.08mg/L、（NH4）6M07024·4H200.02mg/L）为对照，在生菜幼苗定植后的10d、15d、20d、25d分别对各处理进行取样，进行形态指标和生理指标及营养品质指标的测定。叶绿素测量方法：取植株体上部叶片擦净组织表面污物剪碎后称取剪碎的叶片100mg放入盛有10mL DMSO（Dimethyl Sulphoxide）的试管中。静置30分钟于65℃水浴箱中，直至叶片完全变白。把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以DMSO叶绿素提取液为空白，在波长663nm和645nm下用分光光度计测定吸收光度。 计算公式：总叶绿素（g L-1）=0.0202*Abs645+0.0082*Abs663
通过对各处理各项指标的比较，最终确定最适宜叶菜生长的养分供给方案。
2.3半封闭式立体多层栽培系统内叶菜类的栽培技术构建
对半封闭式叶菜立体多层栽培系统进行养分供应、循环技术及最佳层间高度等方面的调试，确定最佳的半封闭式叶菜立体多层栽培系统栽培模式，通过技术集成，构筑低投入、高效率的植物工厂。
3结果与分析
3.1土壤微生物的采集及筛选
本实验为筛选活性较强的土壤微生物，利用分子生物学技术克隆菌种序列，测序后经过序列分析，鉴定菌种名称并分类，最后通过革兰氏染色了解菌种类别。
3.2无机养分有机化栽培筛选
3.2.1发酵菌种的筛选：将筛选的菌液根据最佳发酵条件，发酵为有机养分供给植物工厂内不同生长时期的生菜，将化学营养液作为对照。实验结果如表1所示，有的菌种发酵后所含养分能提供不同生长时期生菜的养分需求，其中6号菌种培养的生菜在叶长、叶宽、叶面积、叶绿素、根长等方面都起到促进作用，而其它菌培育的生菜与对照相比均有不同的下降趋势。因此，根据表1的数据分析，虽然各处理问未见显著差异，但6号菌在叶面积一项中与其它菌存在显著差异，综合生物酶鉴定结果，我们最终决定选择6号菌进行下一步的发酵原料实验。
3.2.2发酵原料的筛选：在本实验中，我们选择糖蜜为基本发酵原料，6号菌为发酵液，在外部环境相同的条件下，分别验证化肥、猪粪发酵后制成有机养分对盆栽生菜生长影响。如表2所示，糖蜜、化肥和猪粪混合及糖蜜、化肥混合的两种发酵液浇灌的生菜，在形态指标和生理指标均表现出明显趋势，比糖蜜单独浇灌的长势好，三种发酵液中，糖蜜、化肥和猪粪混合的营养液培育的生菜，在鲜重及根长方面均显著增加，说明用糖蜜、化肥和猪粪混合的发酵液可持续供应生菜养分需求，适合作为蔬菜生长期的肥料，这为下一步植物工厂发酵液的配置提供了参考。
3.3不同LED光源指标筛选：根据相关文献的查阅，植物对红光有效吸收波长范围为600-680nm之间，对蓝光的有效吸收波长为400-460nm之间，因此，为了筛选植物生长的最佳光源指标，本研究分别设置了上海系统LED、光机所LED、雷士日光灯、上海混合LED等五种不同光质的光照，将自然光作为对照，实验结果如表3，根据表3我们发现，并非所有的人工光源都能改善植物的品质，如光机所LED、雷士日光灯和上海混合LED培养的生菜在叶长、叶宽、叶面积等形态指标都有下降趋势，生菜的外观长势不如自然光条件下生长的好，在营养品质和生物量等方面也显著降低。因此，这三种光源不适合在植物工厂内应用。使用雷士日光灯的生菜在叶绿素积累方面的能力明显弱于使用LED光源的生菜，這也证实了LED系统确实有提高植物营养价值方面的能力，上海系统LED无土栽培的生菜的形态指标、营养品质和生物量显著增加，说明上海LED灯光指标比较适合植物的生长，表明适宜植物生长的红蓝白光比例为11：3：4。
3.4立体多层栽培系统的建立
3.4.1不同栽培模式的比较：植物工厂内，比较常见的栽培模式为雾培、水培和滴溅三种方式，本实验以植物工厂内生菜为试材，比较三种栽培模式下生菜的长势表现，为植物工厂标准化生产提供依据。如表4所示，在不同模式下栽培，生菜的表现各不相同，说明不同的栽培方式对植株生长影响较大，只有选择正确培养方式，才能获得高产。通过三种不同设施栽培方式对比我们发现，用雾培方式培养的生菜在植株长势（叶片数、叶长、叶宽、叶面积）、营养品质（叶绿素）及生物量（鲜重、根长）均优于水培和滴溅。
3.4.2不同营养液对生菜生长的影响：本实验利用有机营养液进行生菜培育，结果表明，施用有机营养液配方标准浓度与施用化学营养液相比，生菜植株生长发育较好，如表5所示，植株在形态、光合特性及产量上均有所提高，叶绿素和鲜重分别增长了17.83%和17.80%，并且有机养分培育的生菜根系明显化学营养液培育的根系粗壮，根长显著大于化学培养的生菜，说明有机养分对生菜根系生长有促进作用。
小结：
1.本实验分离了土壤微生物20种，继代培养后，选择代谢能力较强的微生物菌种9种，分别测定了9种菌的最佳发酵条件；将微生物菌种发酵后，为生菜生长发育的不同时期供应养分，通过对生菜的形态指标、生理指标和营养指标的影响，确定了适宜叶菜生长最佳养分；筛选了不同光源条件，通过光强、照度等的调控增加光合产物的形成，解决了光合作用达不到最优化生长的问题。
2.在半封闭式立体多层栽培系统内有效利用微生物筛选、驯化、发酵工艺研究，将无机养分有机化后供植物体利用，降低了叶菜内亚硝酸盐含量，提高了叶菜的抗氧化活性及维生素含量等，从而提高了叶菜的品质和口感。提高了单位面积内叶菜的产量，且不受季节制约。
3.针对生菜生产我们得出适合植物工厂高效生产的栽培体系如下：①在筛选的众多土壤菌种中，6号菌可作为无机养分转化有机养分的最佳菌种。②栽培方式选择雾培方式较佳。③使用糖蜜、化肥和猪粪共同发酵的有机养分生产的生菜产量较高。④利用LED人工补光的红、蓝、白光的最佳比例为11：3：4。