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[摘要]组织工程皮肤作为一种皮肤组织替代物，主要用于覆盖和修复损伤缺损的皮肤组织，以改善其形态和功能。其中，种子细胞、支架材料及细胞因子是皮肤组织工程研究的三要素。脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有来源丰富、取材方便、低免疫原性、易扩增等优点，是皮肤组织工程较为理想的种子细胞。本文就ADSCs在组织工程皮肤中，包括创面修复、抑制瘢痕增生等的相关应用研究进展及前景进行综述。
[关键词]脂肪干细胞；皮肤组织工程；种子细胞；修复
[中图分类号]R644 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2016）06-0030-04
皮肤作为人体最大的组织器官，覆于体表，起到维持机体内环境稳定、阻止外界有害物质入侵等十分重要的作用。临床上，自体皮源的缺乏常致大面积烧伤和严重创伤患者创面难以及时修复，严重影响机体的形态和功能，甚至危及到患者生命。近年来，随着组织工程技术及有关生命科学的不断发展而兴起的组织工程皮肤替代物，不仅能够及时覆盖创面，减少体内水分及电解质的丢失，维护内环境的稳定，而且还能够减少创面愈合远期瘢痕的增生，改善创面的外观和患者的身心健康。因此，组织工程化皮肤具有广阔而深远的临床应用前景。
种子细胞、支架材料及细胞因子是皮肤组织工程研究的三要素。近年来，有可能作为种子细胞的干细胞拥有良好的多分化潜能及细胞因子分泌功能，己越来越被研究者所重视。干细胞的主要来源有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞等，但因胚胎干细胞有一定的免疫原性、涉及一定的伦理学问题，骨髓干细胞（bolle marrow stem cells，BMSCs）来源少、取材时创伤大，极大地限制了它们的临床应用，脂肪干细胞（adiposed derived stem cell，ADSCs）具有来源丰富、取材方便、低免疫原性、易扩增等优点，成为目前皮肤组织工程较为理想的种子细胞之一。本文就ADSCs在组织工程皮肤中的相关应用研究进展及前景进行综述。
1.ADSCs的分离培养及生物学特性
1.1ADSCs的分离纯化：ADSCs主要来源于人体脂肪组织，其提取及培养步骤相对较多，在分离的基础上结合相应的纯化方法，便能够得到纯度相对较高的脂肪干细胞。
ADSCs分离方法主要沿用了问充质干细胞的分离流程，包括酶消化法及非酶促分离法两大类。酶消化法的主要原理是通过胶原酶消化细胞间的胶原组织，使细胞相互分离，再通过过滤、洗涤和离心等步骤分离获得脂肪干细胞，分离速度较快，缺点是胶原酶较为昂贵，而且在酶的种类、所需浓度及作用时间上缺乏统一标准，需要靠操作者凭借个人的经验来判断。非酶促分离法包括组织块贴壁法、直接离心法、吸附柱法等其中，贴壁法需要解决的主要问题是组织块贴壁难，换液时容易漂浮，如果这一问题能够被有效地解决，其将是一种应用前景十分可观的分离方法；吸附柱法是利用聚乙烯织物等做成的吸附柱装置对贴壁细胞的亲和力作用而分离脂肪干细胞，虽然价格相对低廉，但需要样品量较大。上述的各种ADSCs分离方法各有优缺点，尚无统一的标准，因此寻找一种操作简单、成本低廉的ADSCs分离方法仍是未来ADSCs研究领域的重要内容。
分离后为了得到纯度较高的ADSCs，紧接着便是ADSCs纯化。目前常用的ADSCs纯化方法包括：免疫磁珠分选和密度梯度离心法，由于免疫磁珠分选法涉及到的设备及抗体均比较昂贵，不适合普通的研究机构广泛应用，而密度梯度离心的方法虽然步骤相对较繁琐，但成本会低很多，因此其是相对较为理想可行的纯化方法。
1.2ADSCs的表面标志物：虽然目前对ADSCs免疫表型的鉴定做了大量工作，但ADSCs的表面标志物繁杂，尚未发现特异性的可用于鉴别的表面标志物。现普遍认为ADSCs表达CD13、CD71、CD73、CD29、CD90、CD105和CD166等表面抗原标志，而不表达CD11、CD19、CD31、CD33、CD38、CD45等。表达CD73、CD105和CD90，不表达CD45，并在体外能够诱导分化成为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞，是ADSCs作为人类间充质干细胞的最低标准。
1.3ADSCs的多向分化潜能：自2001年首次从人脂肪中成功分离并得以体外培养以来，ADSCs能够在一定条件下被成功诱导分化为内胚层、中胚层及外胚层的众多细胞系，如肌肉细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及角质细胞、成纤维细胞和内皮细胞等，具有多向分化潜能例如，在一定条件下ADSCs能够诱导分化为肝细胞样细胞，不但能够表达产生白蛋白和甲胎蛋白，还拥有吸收低密度脂蛋白LDL、储存糖原等类似人类肝脏细胞的功能。而早年Safford等人就分别通过实验研究证明ADSCs在一定条件下可以诱导分化成为神经元样细胞。不仅如此，ADSCs还有神经保护作用，移植到周围神经损伤处的ADSCs可以通过减少小胶质细胞的生成、分泌BDNF等神经营养因子来促进轴突生长起到神经保护作用。此外，在体外增殖许多代的子代脂肪干细胞仍具有完好的表面标志物及较强的分化潜能，表明其作为皮肤组织工程的种子细胞具有巨大的优势。
2.ADSCs与皮肤组织工程
2.1ADSCs可以作为皮肤组织工程皮肤的种子细胞：ADSCs在临床上易于大量获得，而且可以自体移植不涉及相关的伦理问题，作为组织工程的种子细胞近年来越来越受到研究者的青睐，己被广泛应用到软骨组织工程、骨组织工程和脂肪组织工程等的研究应用当中。如前所述，ADSCs在体外诱导下，可成功向上皮细胞和角质细胞分化。Derby等将ADSCs组织移植到小鼠真皮层后可成功诱导其分化为表皮干细胞，并表达表皮干细胞细胞标志物p63。将ADSCs种植于人脱细胞真皮上培养，加入表皮生长因子和高浓度的钙离子后，ADSCs能够成功分化成为角质形成细胞，并能够形成类似于正常皮肤组织的复层表皮结构，实现皮肤组织工程中表皮的再生。这些优良特性都是其作为皮肤组织工程种子细胞的坚实基础。 2.2ADSCs与皮肤组织工程支架材料能够有机结合：理想的组织工程皮肤支架材料应该有良好的机械性能（主要包括机械强度和伸缩性能）、良好的生物相容性（能够引导细胞粘附及生长，为种子细胞的生长繁殖提供适宜的空间）和无毒副作用的降解产物等特点。按照其化学性质的不同，组织工程皮肤支架材料主要可分为天然支架材料和合成支架材料，天然支架材料拥有良好的生物相容性，但生物力学性能相对较差，而人工合成支架材料的生物力学性能优于天然支架材料，但往往有一定的细胞毒性，限制其广泛应用及发展。目前研究较热的合成支架材料主要是聚焦内酯及聚内酯等聚酯类材料，天然生物支架材料主要是胶原类、壳聚糖类及纤维蛋白类等。
研究表明，众多的皮肤组织工程支架材料能够与脂肪干细胞有机结合，引导脂肪干细胞的粘附和增殖，构建的复合皮肤组织局部应用能够很好的促进创面愈合，减少瘢痕的增生。如利用静电纺丝技术制备的纯聚合材料
聚乳酸聚己内酯PLCL及PLCL/Poloxamer与大鼠脂肪干细胞的相容性良好，在微观结构上能与细胞外基质较一致，非常适合脂肪干细胞的黏附及增殖，且其柔韧性及机械性好、抗磨损，是广泛应用于组织工程的支架材料。以3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚物poly（3-hydroxybutyrate-co-3hydroxyvalerate）（PHBV）作为真皮支架，能够更好地为ADSCs提供良好的力学支撑及适当的微环境，保持创面水分的同时，还拥有足够的机械性能以抑制创面的收缩，7d后ADSCs能够通过分泌VEGF和bFGF而促进血管再生，28d后移植的PHBV支架完全降解，随后在PHBV原位生成的真皮拥有更加复杂的胶原结构，并能够通过减少TGF-B 1和a-SMA和增加TGF-B 3的分泌抑制创面瘢痕的增生。
2.3ADSCs能够分泌多种细胞因子，促进组织工程皮肤的重建：各类具有活性的生长因子为种子细胞的生长繁殖提供营养物质和调节作用。研究表明，ADSCs拥有强大的分泌能力，能够分泌血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、纤维母细胞生长因子、胎盘生长因子、粒细胞巨噬细胞刺激因子、胰岛素样生长因子、血管生成素等众多生长因子，这些细胞因子具有调节种子细胞增殖、迁移、分化及蛋白的表达、维持其生物学功能、促进血管生成、调节免疫原性等十分重要的作用，能够促进组织工程皮肤的重建。
3.ADSCs与创面愈合
3.1ADSCs能够促进创面愈合：创面修复是一个复杂的过程，涉及到炎症反应、血管的生成和新生组织的产生和重塑等过程。脂肪源性干细胞能够将自己和周围的局部微环境整合到一起，加速创面修复并分化成所需要的细胞，还能通过自分泌及旁分泌的形式分泌EGF、VEGF、vWF、VEGF等众多细胞因子，刺激血管再生，减轻创面局部炎症反应，促进周围的细胞分化增殖等，从而会显著的促进创面的愈合。
3.2ADSCs能够减少创面瘢痕的增生：瘢痕增生在创面愈合过程中往往难以避免，病理性瘢痕的形成常常会严重影响机体的美观和功能，使患者心身健康受到影响，严重者在临床防治和康复整形治疗上的花费甚至远远高于其原发疾病的治疗费用。而ADSCs的局部应用能够通过减少a-SMA和I型胶原的产生，改善胶原的排列等作用，有效的减少创面修复过程中瘢痕的增生。不仅如此，ADSCs的应用还可以软化皮肤皱纹、通过抑制黑色素合成酶从而抑制黑素细胞的增殖和黑色素的合成、减少色素沉着、达到美白的效果，最大限度的恢复患者创面的外观和功能，减少患者的心理负担，有可能是未来创面修复的理想选择之一。
4.展望
ADSCs作为皮肤组织工程的种子细胞，既不涉及伦理问题，又有着充足的来源，简单易得，但至今尚未发现一种公认、专一的ADSCs特异性标记物，所以其分离、培养及鉴别尚无统一模式，有待于进一步研究。
虽然组织工程皮肤在烧伤、慢性难愈性创面及先天性皮肤畸形等诸多疾病的治疗领域取得了一定的成效，但作为种子细胞ADCSs向多种组织定向分化的机制目前尚不明确，而且扩增的ADSCs是否有癌变倾向也无数据证实，ADSCs作为种子细胞与支架材料、细胞因子相结合的皮肤替代物的长期临床效果还没有得到很好的证实，再加上人体皮肤组织本身的复杂性，以及对人类皮肤自身结构研究的不透彻性，因此，ADSCs与组织工程化皮肤的研究，要想完全达到人体正常皮肤功能状态仍有很长的路要走。
[关键词]脂肪干细胞；皮肤组织工程；种子细胞；修复
[中图分类号]R644 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2016）06-0030-04
皮肤作为人体最大的组织器官，覆于体表，起到维持机体内环境稳定、阻止外界有害物质入侵等十分重要的作用。临床上，自体皮源的缺乏常致大面积烧伤和严重创伤患者创面难以及时修复，严重影响机体的形态和功能，甚至危及到患者生命。近年来，随着组织工程技术及有关生命科学的不断发展而兴起的组织工程皮肤替代物，不仅能够及时覆盖创面，减少体内水分及电解质的丢失，维护内环境的稳定，而且还能够减少创面愈合远期瘢痕的增生，改善创面的外观和患者的身心健康。因此，组织工程化皮肤具有广阔而深远的临床应用前景。
种子细胞、支架材料及细胞因子是皮肤组织工程研究的三要素。近年来，有可能作为种子细胞的干细胞拥有良好的多分化潜能及细胞因子分泌功能，己越来越被研究者所重视。干细胞的主要来源有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞等，但因胚胎干细胞有一定的免疫原性、涉及一定的伦理学问题，骨髓干细胞（bolle marrow stem cells，BMSCs）来源少、取材时创伤大，极大地限制了它们的临床应用，脂肪干细胞（adiposed derived stem cell，ADSCs）具有来源丰富、取材方便、低免疫原性、易扩增等优点，成为目前皮肤组织工程较为理想的种子细胞之一。本文就ADSCs在组织工程皮肤中的相关应用研究进展及前景进行综述。
1.ADSCs的分离培养及生物学特性
1.1ADSCs的分离纯化：ADSCs主要来源于人体脂肪组织，其提取及培养步骤相对较多，在分离的基础上结合相应的纯化方法，便能够得到纯度相对较高的脂肪干细胞。
ADSCs分离方法主要沿用了问充质干细胞的分离流程，包括酶消化法及非酶促分离法两大类。酶消化法的主要原理是通过胶原酶消化细胞间的胶原组织，使细胞相互分离，再通过过滤、洗涤和离心等步骤分离获得脂肪干细胞，分离速度较快，缺点是胶原酶较为昂贵，而且在酶的种类、所需浓度及作用时间上缺乏统一标准，需要靠操作者凭借个人的经验来判断。非酶促分离法包括组织块贴壁法、直接离心法、吸附柱法等其中，贴壁法需要解决的主要问题是组织块贴壁难，换液时容易漂浮，如果这一问题能够被有效地解决，其将是一种应用前景十分可观的分离方法；吸附柱法是利用聚乙烯织物等做成的吸附柱装置对贴壁细胞的亲和力作用而分离脂肪干细胞，虽然价格相对低廉，但需要样品量较大。上述的各种ADSCs分离方法各有优缺点，尚无统一的标准，因此寻找一种操作简单、成本低廉的ADSCs分离方法仍是未来ADSCs研究领域的重要内容。
分离后为了得到纯度较高的ADSCs，紧接着便是ADSCs纯化。目前常用的ADSCs纯化方法包括：免疫磁珠分选和密度梯度离心法，由于免疫磁珠分选法涉及到的设备及抗体均比较昂贵，不适合普通的研究机构广泛应用，而密度梯度离心的方法虽然步骤相对较繁琐，但成本会低很多，因此其是相对较为理想可行的纯化方法。
1.2ADSCs的表面标志物：虽然目前对ADSCs免疫表型的鉴定做了大量工作，但ADSCs的表面标志物繁杂，尚未发现特异性的可用于鉴别的表面标志物。现普遍认为ADSCs表达CD13、CD71、CD73、CD29、CD90、CD105和CD166等表面抗原标志，而不表达CD11、CD19、CD31、CD33、CD38、CD45等。表达CD73、CD105和CD90，不表达CD45，并在体外能够诱导分化成为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞，是ADSCs作为人类间充质干细胞的最低标准。
1.3ADSCs的多向分化潜能：自2001年首次从人脂肪中成功分离并得以体外培养以来，ADSCs能够在一定条件下被成功诱导分化为内胚层、中胚层及外胚层的众多细胞系，如肌肉细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及角质细胞、成纤维细胞和内皮细胞等，具有多向分化潜能例如，在一定条件下ADSCs能够诱导分化为肝细胞样细胞，不但能够表达产生白蛋白和甲胎蛋白，还拥有吸收低密度脂蛋白LDL、储存糖原等类似人类肝脏细胞的功能。而早年Safford等人就分别通过实验研究证明ADSCs在一定条件下可以诱导分化成为神经元样细胞。不仅如此，ADSCs还有神经保护作用，移植到周围神经损伤处的ADSCs可以通过减少小胶质细胞的生成、分泌BDNF等神经营养因子来促进轴突生长起到神经保护作用。此外，在体外增殖许多代的子代脂肪干细胞仍具有完好的表面标志物及较强的分化潜能，表明其作为皮肤组织工程的种子细胞具有巨大的优势。
2.ADSCs与皮肤组织工程
2.1ADSCs可以作为皮肤组织工程皮肤的种子细胞：ADSCs在临床上易于大量获得，而且可以自体移植不涉及相关的伦理问题，作为组织工程的种子细胞近年来越来越受到研究者的青睐，己被广泛应用到软骨组织工程、骨组织工程和脂肪组织工程等的研究应用当中。如前所述，ADSCs在体外诱导下，可成功向上皮细胞和角质细胞分化。Derby等将ADSCs组织移植到小鼠真皮层后可成功诱导其分化为表皮干细胞，并表达表皮干细胞细胞标志物p63。将ADSCs种植于人脱细胞真皮上培养，加入表皮生长因子和高浓度的钙离子后，ADSCs能够成功分化成为角质形成细胞，并能够形成类似于正常皮肤组织的复层表皮结构，实现皮肤组织工程中表皮的再生。这些优良特性都是其作为皮肤组织工程种子细胞的坚实基础。 2.2ADSCs与皮肤组织工程支架材料能够有机结合：理想的组织工程皮肤支架材料应该有良好的机械性能（主要包括机械强度和伸缩性能）、良好的生物相容性（能够引导细胞粘附及生长，为种子细胞的生长繁殖提供适宜的空间）和无毒副作用的降解产物等特点。按照其化学性质的不同，组织工程皮肤支架材料主要可分为天然支架材料和合成支架材料，天然支架材料拥有良好的生物相容性，但生物力学性能相对较差，而人工合成支架材料的生物力学性能优于天然支架材料，但往往有一定的细胞毒性，限制其广泛应用及发展。目前研究较热的合成支架材料主要是聚焦内酯及聚内酯等聚酯类材料，天然生物支架材料主要是胶原类、壳聚糖类及纤维蛋白类等。
研究表明，众多的皮肤组织工程支架材料能够与脂肪干细胞有机结合，引导脂肪干细胞的粘附和增殖，构建的复合皮肤组织局部应用能够很好的促进创面愈合，减少瘢痕的增生。如利用静电纺丝技术制备的纯聚合材料
聚乳酸聚己内酯PLCL及PLCL/Poloxamer与大鼠脂肪干细胞的相容性良好，在微观结构上能与细胞外基质较一致，非常适合脂肪干细胞的黏附及增殖，且其柔韧性及机械性好、抗磨损，是广泛应用于组织工程的支架材料。以3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚物poly（3-hydroxybutyrate-co-3hydroxyvalerate）（PHBV）作为真皮支架，能够更好地为ADSCs提供良好的力学支撑及适当的微环境，保持创面水分的同时，还拥有足够的机械性能以抑制创面的收缩，7d后ADSCs能够通过分泌VEGF和bFGF而促进血管再生，28d后移植的PHBV支架完全降解，随后在PHBV原位生成的真皮拥有更加复杂的胶原结构，并能够通过减少TGF-B 1和a-SMA和增加TGF-B 3的分泌抑制创面瘢痕的增生。
2.3ADSCs能够分泌多种细胞因子，促进组织工程皮肤的重建：各类具有活性的生长因子为种子细胞的生长繁殖提供营养物质和调节作用。研究表明，ADSCs拥有强大的分泌能力，能够分泌血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、纤维母细胞生长因子、胎盘生长因子、粒细胞巨噬细胞刺激因子、胰岛素样生长因子、血管生成素等众多生长因子，这些细胞因子具有调节种子细胞增殖、迁移、分化及蛋白的表达、维持其生物学功能、促进血管生成、调节免疫原性等十分重要的作用，能够促进组织工程皮肤的重建。
3.ADSCs与创面愈合
3.1ADSCs能够促进创面愈合：创面修复是一个复杂的过程，涉及到炎症反应、血管的生成和新生组织的产生和重塑等过程。脂肪源性干细胞能够将自己和周围的局部微环境整合到一起，加速创面修复并分化成所需要的细胞，还能通过自分泌及旁分泌的形式分泌EGF、VEGF、vWF、VEGF等众多细胞因子，刺激血管再生，减轻创面局部炎症反应，促进周围的细胞分化增殖等，从而会显著的促进创面的愈合。
3.2ADSCs能够减少创面瘢痕的增生：瘢痕增生在创面愈合过程中往往难以避免，病理性瘢痕的形成常常会严重影响机体的美观和功能，使患者心身健康受到影响，严重者在临床防治和康复整形治疗上的花费甚至远远高于其原发疾病的治疗费用。而ADSCs的局部应用能够通过减少a-SMA和I型胶原的产生，改善胶原的排列等作用，有效的减少创面修复过程中瘢痕的增生。不仅如此，ADSCs的应用还可以软化皮肤皱纹、通过抑制黑色素合成酶从而抑制黑素细胞的增殖和黑色素的合成、减少色素沉着、达到美白的效果，最大限度的恢复患者创面的外观和功能，减少患者的心理负担，有可能是未来创面修复的理想选择之一。
4.展望
ADSCs作为皮肤组织工程的种子细胞，既不涉及伦理问题，又有着充足的来源，简单易得，但至今尚未发现一种公认、专一的ADSCs特异性标记物，所以其分离、培养及鉴别尚无统一模式，有待于进一步研究。
虽然组织工程皮肤在烧伤、慢性难愈性创面及先天性皮肤畸形等诸多疾病的治疗领域取得了一定的成效，但作为种子细胞ADCSs向多种组织定向分化的机制目前尚不明确，而且扩增的ADSCs是否有癌变倾向也无数据证实，ADSCs作为种子细胞与支架材料、细胞因子相结合的皮肤替代物的长期临床效果还没有得到很好的证实，再加上人体皮肤组织本身的复杂性，以及对人类皮肤自身结构研究的不透彻性，因此，ADSCs与组织工程化皮肤的研究，要想完全达到人体正常皮肤功能状态仍有很长的路要走。