甜高粱(辽甜系列)再生体系建立与比较

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  摘 要 建立了辽宁省能源专用甜高粱再生体系,筛选适合组织培养的辽甜系列品种,为遗传转化奠定基础。以辽甜系列甜高粱芽基部为外植体,在添加不同激素浓度的MS培养基上诱导愈伤组织,进而获得再生植株。辽甜4号和辽甜7号在添加500 mg/L水解酪蛋白和3 mg/L 2,4-D的MS培养基上能够诱导出生长状态良好的愈伤组织,愈伤组织诱导率达到92%和89%,辽甜4号愈伤组织分化能力比较强,在含有1 mg/L IAA和0.5 mg/L 6-BA的MS培养基上分化率为76%;辽甜1号和辽甜5号出愈率相对较低,愈伤组织状态差,再生能力较弱。结果表明,能源用甜高粱辽甜系列品种中,辽甜4号更适用于组织培养和遗传转化。
  关键词 甜高粱;愈伤组织;成熟种子;芽基部;再生体系
  中图分类号:S566.5 文献标志码:B DOI:10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.32.060
  甜高粱[Sorghum bicolor(L).Moench]是C4作物中光合作用效率较高作物之一,生长迅速、糖分积累快、生物学产量高,具有抗旱、耐涝、耐贫瘠、耐盐碱和乙醇转化率高等优点,被认为是最具开发潜力的能源作物之一[1]。然而甜高粱种质资源的匮乏,尤其抗倒伏、含糖量高的品种资源缺乏,传统的常规育种己不能满足人们对高能作物甜高粱的需求,分子育种能方便快捷的将所需的优良基因转入作物,进而获得性状优良的作物品种[2]。建立方便、稳定、高效的再生体系和遗传转化体系,是分子育种的基础。甜高粱是公认的再生体系较难的一种作物,大量研究结果表明,高粱愈伤组织的诱导和再生,受到诸多因素的影响。不同品种的选择、外植体的选择、培养基成分、外源激素的配比等都是影响高粱组织培养成功的关键因素。以往的研究中,甜高粱的组培多以幼胚、幼穗为外植体,但获取幼胚和幼穗费时、费力,同时受季节、地域的限制,难以保证稳定充足的外植体供应。而来源于成熟种子的外植体,如成熟种子、成熟胚、芽顶端分生组织等可以保证外植体的稳定供给。辽宁省农业科学院高粱研究所育成的能源专用甜高粱辽甜系列品种,具有优质、高产、多抗、广适等特点。本研究以能源专用甜高粱(辽甜系列品种)成熟种子为材料,选取成熟种子萌发后嫩芽组织的膨大部分为外植体,通过调整培養基激素浓度,筛选出最佳诱导、分化培养基,减轻褐化及水渍化问题;比较不同辽甜品种愈伤组织的诱导,分化及再生能力,筛选适宜组织培养的品种,为后续基因工程研究奠定基础。
  1 材料与方法
  1.1 材料
  本研究选用的试验材料为辽甜系列品种:辽甜1号、4号、6号和辽甜7号,由辽宁省农业科学院高粱研究所提供。
  1.2 方法
  1.2.1 芽基部膨大组织的分离
  将甜高粱种子用75%的乙醇灭菌1 min,然后用0.1%的升汞灭菌15 min,最后用无菌水洗涤6~7次,用无菌滤纸将种子表面水分吸干。将灭菌后的种子胚面朝下,接种于MS+500 mg/L酸水解酪蛋白+2,4-D(2.0、3.0和4.0 mg/L)的诱导培养基中,(25±2)℃黑暗条件下培养3~7 d。选择芽基部膨大的正常种子,无菌条件下切取带有种子的膨大部分转移到继代培养基中继续培养,并统计不同品种萌发种子膨大率。
  1.2.2 继代培养
  培养5~7 d后,根据膨大部分愈伤组织形成情况,将生长良好的愈伤组织转移到MS+500 mg/L酸水解酪蛋白+3.0 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L KT的继代培养基上,(25±2)℃黑暗条件下培养28 d。
  1.2.3 植株再生
  将生长良好的愈伤组织接种于分化培养基(MS+1 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA)上培养30 d,再将芽转入生根培养基(MS+3 mg/L IBA)上,培养条件为(25±2)℃,每天16 h光照,光照强度为35 μmol/(m2·s)。
  1.3 试验数据的统计分析
  初始分生组织膨大率=(接种一周后膨大的分生组织块数目/接种的外植体数目)×100%;
  愈伤组织诱导率=(接种四周后愈伤组织数目/接种的外植体数目)×100%;
  愈伤组织分化率=(诱导出的丛生芽块数目/转接的膨大分生组织块数目)×100%。
  2 结果与分析
  2.1 芽基部膨大率及愈伤组织的诱导
  将无菌的成熟的种子置于诱导培养基上,黑暗培养4~5 d后,芽基部均出现膨大现象。四个品种在2,4-D浓度为3.0 mg/L的诱导培养基中膨大组织的生长状态好于其他诱导培养基。如图1所示,辽甜4号和辽甜7号芽基部膨大率较高,分别为100%和98%,并且生长状态较好,出现愈伤组织;辽甜1号和辽甜5号芽基部膨大率相对较低,分别为84%和88%,并且膨大组织部分出现褐化现象,生长状态较差。
  2.2 愈伤组织的继代
  将生长良好的愈伤组织转移到含有低浓度KT的继代培养基上,继代时需将诱导时留着的种子部分切除,减少褐化,每2周继代一次,共继代2次,继代过程中愈伤组织形成率有明显的差异。如图2所示,辽甜4号和辽甜7号愈伤组织生长良好,体积明显增大,且愈伤组织结构致密,颜色呈淡黄色,愈伤组织最终诱导率分别为92%和89%;辽甜1号和辽甜5号愈伤组织最终诱导率分别为36%和24%,并且辽甜1号愈伤组织质地坚硬生长缓慢,而辽甜5号愈伤组织出现了水渍化和褐化问题。
  2.3 再生植株的形成
  将最终得到的愈伤组织转移到分化培养基上,5~6 d后愈伤组织表面出现绿色,1~2周后愈伤组织表面出现绿色芽点,3~4周后生长出不定芽。辽甜4号和辽甜7号最终分化率分别为76%和48%,而辽甜1号和辽甜5号分别为12%和9%。將不定芽转移至生根培养基中,4~6周后得到完整植株。   3 讨论
  3.1 外植体的选择与处理
  甜高粱再生體系的建立中,外植体的选择与处理是诱导初期的关键步骤。本研究选用成熟种子,取材方便,不受时空限制。待其芽长到2 cm左右时(约4~5 d),芽基部渐渐出现膨大,将其芽轴及芽尖切除,并保留膨大部分和胚乳部分3~5 d,待芽基部愈伤组织稳定形成后,再将胚乳部分切除。此方法使胚性愈傷组织形成率提高了17%,但胚乳部分也不能长时间保留,营养耗尽后,颜色加深,出现干瘪现象,此时要及时去除。
  对比发现,直接切除胚乳部分的外植体,极易出现水渍状,最终褐化。同时,若种子胚乳部分与膨大部分接触点出现了黑色褐化,要及时将种子胚乳部分去除,减少褐化。
  3.2 组织培养过程中的褐化问题
  研究表明,若离体材料较小,极易出现褐化,外植体受伤害程度如切口面积过大也会加重褐变程度。本研究对外植体的处理中,胚乳部分的切除与否也会影响褐化程度,导致这种现象的原因除了离体材料大小及切口面积外,也可能因为胚乳里面含有相应的生长激素或酶类,减少了褐化,有利于愈伤组织的形成,对新生组织有一定的保护作用。在继代时发现有些愈伤组织出现褐化,但未接触培养基的愈伤组织正常生长,下面部分出现了褐化现象,可能是组织的一种自我保护,确保了上面的愈伤组织正常生长,有些愈伤组织出现水渍状,这种愈伤组织不再具有分化能力,可通过提高琼脂的浓度来改善。
  3.3 不同品种间组织培养与再生能力比较
  不同品种的甜高粱在组织培养及再生能力方面存在差异。四个辽甜品种中,辽甜4号的愈伤组织诱导效率高、生长较快、结构紧密、颜色淡黄,且辽甜4号无论在初始分生组织膨大率、愈伤组织诱导率和愈伤组织分化率上都高于其他辽甜品种。这可能是由于不同品种的基因型不同。
  4 结论
  本研究以能源专用甜高粱辽甜系列品种成熟种子为材料,建立并改进了甜高粱再生体系,发现诱导培养基中种子发芽2 d后出现膨大,芽长达到2 cm左右时,剪掉其余芽组织,有利于胚性愈伤组织的形成,在愈伤组织稳定形成后,去除种子的胚乳部分,可以减轻褐化和水渍化;同时筛选适宜组织培养的辽甜系列品种,发现辽甜4号品种具有更高的再生能力,更易于组织培养和遗传转化。
  参考文献
  [1]汪家灼.甜高粱杂交种——新的生物质能源[J].内蒙古农业科学,2007(3):75-76.
  [2]葛玉红.甜高粱再生体系的优化研究[D].广西:广西大学农学院,2011.
  (责任编辑:刘昀)
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