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摘 要 甘蔗组织培养技术的应用为甘蔗品种的快速繁殖和良种推广提供了有效的手段，而浅层培养作为植物组培技术的一种，可为完善甘蔗组培苗增殖培养提供不同的解决途径，在不降低增殖效果的前提下，降低培养基的使用量，从而降低生产成本。本试验在使用相同配方[MS液体培养基（30 g/L的蔗糖+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）pH 6.0]、不同容量的培养基对甘蔗组培苗进行增殖培养，并观察对比其增殖效果，以确认浅层培养是否具有较好的增殖效果。结果表明：在增殖F2～F5代的培养中，果酱瓶中加入10 mL容量的液体培养基较常用的20 mL容量的液体培养基增殖效果明显。
关键词 甘蔗组培 ；继代增殖 ；浅层培养
分类号 S566.1
Abstract The application of sugarcane tissue culture technique for rapid propagation of sugarcane varieties and improved varieties and provide effective means， and the shallow layer culture as a kind of plant tissue culture techniques， can provide different solutions to improve the proliferation of sugarcane tissue culture seedling culture， does not reduce the proliferation effect of the premise， reduces the medium usage， furtherto reduce the production cost； the test using the same formula [（MS liquid medium， sucrose 30 g/L+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）， pH 6] under different capacity of the medium of sugarcane tissue culture seedlings were cultured to observe the proliferation， the proliferation effect of contrast， to confirm whether the shallow layer culture has good effect through proliferation； experiment showed that， proliferation of cultured in the F2～F5 generation in a jam jar， add 10 mL capacity of the liquid culture medium proliferation effect of commonly used 20 mL capacity of liquid obviously.
Keywords sugarcane tissue ； subculture multiplication ； thin layer liquid tissue
甘蔗是第一个组织培养成功的禾本科植物[1]。作为中国最主要的糖料作物，其产糖量占全国总产糖量的90%以上[2]。甘蔗组织培养技术的应用为甘蔗品种的快速繁殖和良种推广提供了有效的手段。浅层培养作为植物组培技术的一种，可为完善甘蔗组培苗增殖培养提供不同的解决途径。1934年，美国学者White等用番茄根进行组织培养，首次建立了活跃生长的无性繁殖系[3]。1969年，Barba等及Heinz等[4-5]从甘蔗组培培养基实现植株再生。1978年，广西区甘蔗组织培养苗协作组对甘蔗组培体系进行了系统阐述，其中明确提出了使用蔗笋进行愈伤组织诱导、分化、增殖的组培工厂生产体系[6]，该体系为甘蔗组培生产常用的体系。1992年，何明等[7]阐明了甘蔗组培的3种常用方法：液体微繁殖法、固培及早生根诱导法和固液双层培养法，其中液体微繁殖法为甘蔗组培工厂生产中的常用方法，其核心是使用液体培养基对甘蔗组培苗进行增殖扩繁，但文章中并未提及培养基使用量的问题。1980年，周萍[8]首次提出了使用液体浅层培养可诱导烟草愈伤组织，为植物组织培养提供了新的思路。1999年，程丽芬[9]提到了在组培过程中使用广口果酱瓶替代常用的三角瓶可降低试验成本。自2000年起，广西南亚热带农业科学研究所经济组培研究室的组培工厂开始大规模使用果酱瓶进行甘蔗组培苗生产。本研究在前人的研究基础上进行了液体浅层培养的尝试，通过浅层培养达到在不降低增殖效果的前提下，降低培养基的使用量，从而降低生产成本。
1 材料与方法
1.1 材料
甘蔗品种为新台糖22号。挑选生长整齐的增殖F2代瓶苗进行对比试验。试验采用的增殖瓶苗获得的途径为：心叶愈伤组织诱导→分化→增殖F1[5，10]。
1.2 方法
1.2.1 来源瓶苗培养基的配方
心叶愈伤组织培养基配方为：MS固体培养基（蔗糖30 g/L+2.5 mg/L 2，4-D，pH 6.0）；分化培养基配方为：MS固体培养基（蔗糖30 g/L+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，pH 6.0）；增殖F1培养基配方为：MS液体培养基（蔗糖30 g/L+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，pH 6.0）[11]。
1.2.2 试验设计
将增殖F1培养基配方分别按10 mL/瓶（A处理）、20 mL/瓶（B处理）、5 mL/瓶（C处理）共3个处理添加进果酱瓶中，消毒备用。在组培工厂中分别挑选4名熟练工人进行增殖操作，对4人分别编号为：I、II、III、IV（图1）。选取若干瓶生长匀齐的增殖F1瓶苗分别接入培养基中进行相同条件的继代增殖培养。 1.2.3 生长条件
甘蔗继代增殖培养条件为：恒温26℃，光照1 500 lx持续12 h[12]，严格按照甘蔗组培工厂的操作规范（图2），控制污染率低于5%[13]。
1.2.4 接种方法
在无菌环境下，每次换代增殖时，均使用镊子对丛生芽苗进行清理分类，接入新的培养基中[12]。
1.3 数据处理
本试验数据使用SPSS统计产品与服务解决方案软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 增殖结果
每个工人接种起步为100瓶，按照严格的甘蔗组培途径，经过4代增殖后，统计增殖结果见表1（表1数据已剔除相应的污染数）。根据表1所示内容，直观对比，C处理在F2→F3阶段便已经出现较大波动，后期数据已经呈现出下降趋势，这说明C处理不适合甘蔗组培苗的规模化生产，可以剔除数据分析。相比C处理，A处理与B处理在各个阶段的数据均呈现上升趋势，但略有差异，可进一步对这2个处理进行方差分析。经过数代增殖后，A处理与B处理的F4→F5出现较为明显的单瓶差异（图3）。
2.2 增殖与工人间的误差分析
本试验使用工人共4名，对其进行试验误差分析，以排除试验结果的人为因素，保障数据的准确性。使用SPSS 19.0对统计表进行数据分析，结果见表2。F2→F3与工人组间差异的显著性为0.87>0.05，根据SPPS的评测标准，即F2→F3与工人组间差异不显著，同理F3→F4与工人、F4→F5与工人显著性均大于标准判断值0.05，即说明在整个增殖试验期间，相同增殖代数，接种工人之间并不存在较大差异。所以试验结果可排除由工人不同而造成的误差干扰。
2.3 处理间的方差分析
由表1可知，试验处理间存在差异，通过SPSS分析软件，对不同增殖阶段的A、B处理间进行差异分析，结果见表3和表4。
试验结果显示：F2→F3处理组间的差异显著性为0.004<0.05；F3→F4处理组间的差异显著性为0.001<0.05；F4→F5处理组间的差异显著性为0.000<0.05。说明在整个增殖期间，A处理与B处理均达到了差异显著性水平，而且显著性随着增殖代数的不断增加呈上升趋势。对比表4和表1数据可得，A处理增殖效果明显高于B处理。
3 结论与讨论
试验结果表明，5 mL培养基浅层培养不适合甘蔗组培苗的增殖生长，而10 mL培养基浅层培养增殖效果明显高于20 mL普通培养基的增殖效果。
甘蔗组培苗的增殖方法为丛生芽分蘖增殖，是在一团原生质上进行不断的分生而形成的一种增殖方式，甘蔗组培苗的分生点较低，处于增殖苗的底部，过量的液体容易淹埋甘蔗组培苗的分生点使其生长缓慢。使用传统的20 mL培养液培养方法会完全淹没甘蔗组培苗的分生点，不利于新生成的丛生芽的快速萌发，进而导致了在相同时间内丛生芽数的不足；前期对丛生芽芽数的减少影响不大，经过多代的增殖，苗数的增加，影响效果越来越明显，便会影响甘蔗组培苗的增殖率。而浅层培养并没有完全淹没丛生芽的分生点，不仅能有效的吸收培养基中的营养与激素，亦能给原生质提供有效的伸展空间，继而保证了丛生芽的萌发及增殖率。但浅层培养并非过于少量的培养基容量，过于少量的培养基（C处理）会造成营养与激素供应不足，从而影响甘蔗组培苗的生长。因此，10 mL是甘蔗组培苗浅层培养基的最适容量。
参考文献
[1] 许莉萍. 甘蔗组织培养-一种值得发展的生物技术[J]. 国外农学-甘蔗，1992（2）：1-5.
[2] 李奇伟.现代甘蔗改良技术[M].广州：华南理工大学出版社，2001：35.
[3] 葛胜娟. 植物组织培养的发展历史与新技术展望[J]. 世界农业，2011，33（12）：71-75.
[4] Barba R， Nickell L G. Nutrition and organ differentiation in tissue cultures of sugarcane， a monocotyledon[J]. Planta. 1969， 89（3）： 299-302.
[5] 谭志勇. 不同甘蔗品种组织培养特性的研究[J]. 广东农业科学，2005，32（1）：34-36.
[6] 广西区甘蔗组织培养育苗协作组. 甘蔗组织培养育苗试验[J]. 广西农业科学，1980，17（8）：32-36.
[7] 何 明，张子建. 甘蔗组织培养新方法研究[J]. 植物学通报，1992，10（S1）：21-22.
[8] 周 萍. 液体浅层培养烟草原生质体诱导形成愈伤组织及其分化成再生植株的研究[J]. 上海师范大学学报（自然科学版），1980，23（3）：33-39.
[9] 程丽芬. 简化培养基试验[J]. 山西林业科技，1999，28（3）：1-4.
[10] 恽 绵. 我国甘蔗组织培养工厂化育苗技术的应用与展望[J]. 甘蔗糖业，1989，18（5）：13-15.
[11] 李 松，余坤兴，刘丽敏. 甘蔗茎尖胚状体脱毒苗快繁技术研究[J]. 中国糖料，2010，32（4）：1-6.
[12] 吴才文，秦廷豪，宗 兰，等. 甘蔗组培苗快速增殖技术研究[J]. 甘蔗糖业，1997，26（5）：8-14.
[13] 丰 锋. 组培工厂化生产污染的发生与防止[J]. 广西热带农业，2001，14（3）：50-51.
关键词 甘蔗组培 ；继代增殖 ；浅层培养
分类号 S566.1
Abstract The application of sugarcane tissue culture technique for rapid propagation of sugarcane varieties and improved varieties and provide effective means， and the shallow layer culture as a kind of plant tissue culture techniques， can provide different solutions to improve the proliferation of sugarcane tissue culture seedling culture， does not reduce the proliferation effect of the premise， reduces the medium usage， furtherto reduce the production cost； the test using the same formula [（MS liquid medium， sucrose 30 g/L+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）， pH 6] under different capacity of the medium of sugarcane tissue culture seedlings were cultured to observe the proliferation， the proliferation effect of contrast， to confirm whether the shallow layer culture has good effect through proliferation； experiment showed that， proliferation of cultured in the F2～F5 generation in a jam jar， add 10 mL capacity of the liquid culture medium proliferation effect of commonly used 20 mL capacity of liquid obviously.
Keywords sugarcane tissue ； subculture multiplication ； thin layer liquid tissue
甘蔗是第一个组织培养成功的禾本科植物[1]。作为中国最主要的糖料作物，其产糖量占全国总产糖量的90%以上[2]。甘蔗组织培养技术的应用为甘蔗品种的快速繁殖和良种推广提供了有效的手段。浅层培养作为植物组培技术的一种，可为完善甘蔗组培苗增殖培养提供不同的解决途径。1934年，美国学者White等用番茄根进行组织培养，首次建立了活跃生长的无性繁殖系[3]。1969年，Barba等及Heinz等[4-5]从甘蔗组培培养基实现植株再生。1978年，广西区甘蔗组织培养苗协作组对甘蔗组培体系进行了系统阐述，其中明确提出了使用蔗笋进行愈伤组织诱导、分化、增殖的组培工厂生产体系[6]，该体系为甘蔗组培生产常用的体系。1992年，何明等[7]阐明了甘蔗组培的3种常用方法：液体微繁殖法、固培及早生根诱导法和固液双层培养法，其中液体微繁殖法为甘蔗组培工厂生产中的常用方法，其核心是使用液体培养基对甘蔗组培苗进行增殖扩繁，但文章中并未提及培养基使用量的问题。1980年，周萍[8]首次提出了使用液体浅层培养可诱导烟草愈伤组织，为植物组织培养提供了新的思路。1999年，程丽芬[9]提到了在组培过程中使用广口果酱瓶替代常用的三角瓶可降低试验成本。自2000年起，广西南亚热带农业科学研究所经济组培研究室的组培工厂开始大规模使用果酱瓶进行甘蔗组培苗生产。本研究在前人的研究基础上进行了液体浅层培养的尝试，通过浅层培养达到在不降低增殖效果的前提下，降低培养基的使用量，从而降低生产成本。
1 材料与方法
1.1 材料
甘蔗品种为新台糖22号。挑选生长整齐的增殖F2代瓶苗进行对比试验。试验采用的增殖瓶苗获得的途径为：心叶愈伤组织诱导→分化→增殖F1[5，10]。
1.2 方法
1.2.1 来源瓶苗培养基的配方
心叶愈伤组织培养基配方为：MS固体培养基（蔗糖30 g/L+2.5 mg/L 2，4-D，pH 6.0）；分化培养基配方为：MS固体培养基（蔗糖30 g/L+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，pH 6.0）；增殖F1培养基配方为：MS液体培养基（蔗糖30 g/L+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，pH 6.0）[11]。
1.2.2 试验设计
将增殖F1培养基配方分别按10 mL/瓶（A处理）、20 mL/瓶（B处理）、5 mL/瓶（C处理）共3个处理添加进果酱瓶中，消毒备用。在组培工厂中分别挑选4名熟练工人进行增殖操作，对4人分别编号为：I、II、III、IV（图1）。选取若干瓶生长匀齐的增殖F1瓶苗分别接入培养基中进行相同条件的继代增殖培养。 1.2.3 生长条件
甘蔗继代增殖培养条件为：恒温26℃，光照1 500 lx持续12 h[12]，严格按照甘蔗组培工厂的操作规范（图2），控制污染率低于5%[13]。
1.2.4 接种方法
在无菌环境下，每次换代增殖时，均使用镊子对丛生芽苗进行清理分类，接入新的培养基中[12]。
1.3 数据处理
本试验数据使用SPSS统计产品与服务解决方案软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 增殖结果
每个工人接种起步为100瓶，按照严格的甘蔗组培途径，经过4代增殖后，统计增殖结果见表1（表1数据已剔除相应的污染数）。根据表1所示内容，直观对比，C处理在F2→F3阶段便已经出现较大波动，后期数据已经呈现出下降趋势，这说明C处理不适合甘蔗组培苗的规模化生产，可以剔除数据分析。相比C处理，A处理与B处理在各个阶段的数据均呈现上升趋势，但略有差异，可进一步对这2个处理进行方差分析。经过数代增殖后，A处理与B处理的F4→F5出现较为明显的单瓶差异（图3）。
2.2 增殖与工人间的误差分析
本试验使用工人共4名，对其进行试验误差分析，以排除试验结果的人为因素，保障数据的准确性。使用SPSS 19.0对统计表进行数据分析，结果见表2。F2→F3与工人组间差异的显著性为0.87>0.05，根据SPPS的评测标准，即F2→F3与工人组间差异不显著，同理F3→F4与工人、F4→F5与工人显著性均大于标准判断值0.05，即说明在整个增殖试验期间，相同增殖代数，接种工人之间并不存在较大差异。所以试验结果可排除由工人不同而造成的误差干扰。
2.3 处理间的方差分析
由表1可知，试验处理间存在差异，通过SPSS分析软件，对不同增殖阶段的A、B处理间进行差异分析，结果见表3和表4。
试验结果显示：F2→F3处理组间的差异显著性为0.004<0.05；F3→F4处理组间的差异显著性为0.001<0.05；F4→F5处理组间的差异显著性为0.000<0.05。说明在整个增殖期间，A处理与B处理均达到了差异显著性水平，而且显著性随着增殖代数的不断增加呈上升趋势。对比表4和表1数据可得，A处理增殖效果明显高于B处理。
3 结论与讨论
试验结果表明，5 mL培养基浅层培养不适合甘蔗组培苗的增殖生长，而10 mL培养基浅层培养增殖效果明显高于20 mL普通培养基的增殖效果。
甘蔗组培苗的增殖方法为丛生芽分蘖增殖，是在一团原生质上进行不断的分生而形成的一种增殖方式，甘蔗组培苗的分生点较低，处于增殖苗的底部，过量的液体容易淹埋甘蔗组培苗的分生点使其生长缓慢。使用传统的20 mL培养液培养方法会完全淹没甘蔗组培苗的分生点，不利于新生成的丛生芽的快速萌发，进而导致了在相同时间内丛生芽数的不足；前期对丛生芽芽数的减少影响不大，经过多代的增殖，苗数的增加，影响效果越来越明显，便会影响甘蔗组培苗的增殖率。而浅层培养并没有完全淹没丛生芽的分生点，不仅能有效的吸收培养基中的营养与激素，亦能给原生质提供有效的伸展空间，继而保证了丛生芽的萌发及增殖率。但浅层培养并非过于少量的培养基容量，过于少量的培养基（C处理）会造成营养与激素供应不足，从而影响甘蔗组培苗的生长。因此，10 mL是甘蔗组培苗浅层培养基的最适容量。
参考文献
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[3] 葛胜娟. 植物组织培养的发展历史与新技术展望[J]. 世界农业，2011，33（12）：71-75.
[4] Barba R， Nickell L G. Nutrition and organ differentiation in tissue cultures of sugarcane， a monocotyledon[J]. Planta. 1969， 89（3）： 299-302.
[5] 谭志勇. 不同甘蔗品种组织培养特性的研究[J]. 广东农业科学，2005，32（1）：34-36.
[6] 广西区甘蔗组织培养育苗协作组. 甘蔗组织培养育苗试验[J]. 广西农业科学，1980，17（8）：32-36.
[7] 何 明，张子建. 甘蔗组织培养新方法研究[J]. 植物学通报，1992，10（S1）：21-22.
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[9] 程丽芬. 简化培养基试验[J]. 山西林业科技，1999，28（3）：1-4.
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[12] 吴才文，秦廷豪，宗 兰，等. 甘蔗组培苗快速增殖技术研究[J]. 甘蔗糖业，1997，26（5）：8-14.
[13] 丰 锋. 组培工厂化生产污染的发生与防止[J]. 广西热带农业，2001，14（3）：50-51.