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摘 要：为确定微生物法测定米粉中维生素B6含量的不确定度，本文利用SHP-250型生化培养箱，依据GB 5009.154—2016第二法操作指导，进行了米粉中维生素B6的测定。并从样品称量、样品稀释定容、样品测量等方面，分析了微生物测定米粉中维生素B6含量不确定度来源。样品称量、样品稀释定容、样品测量均可以引入维生素B6含量测定不确定度，需要测定操作者从仪器、操作、环境等多个方面严格控制，减小含量测定偏差。
关键词：微生物法;米粉;维生素B6;含量;不确定度
维生素B6又可称之为吡哆素，包括吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺等多个成分，可溶于水，参与人体多种代谢反应。维生素B6是米粉中重要营养组成之一，但因含量处于较低的水平，测定难度较大。《食品安全国家标准 食品中维生素B6的测定》（GB 5009.154—2016）规定了食品中维生素B6的含量测定方法，微生物法为标准第二法，适用于不同类别食品中维生素B6的测定。本文评估了利用GB 5009.154—2016第二法测定米粉中维生素B6含量的不确定度。
1 材料与方法
1.1 材料
SHP-250型生化培养箱、Thermo酶标检测仪、多管式旋涡混合器、水浴锅、0.2 μm无菌滤膜[1]。市售婴幼儿配方米粉、维生素B6标准品（≥99.0%），柠檬酸盐缓冲液（pH为4.5）、马铃薯酸性磷酸酶、无菌水。
1.2 实验方法
1.2.1 操作步骤
在250 mL锥形瓶内，放入2.5 g米粉样品，利用单标线吸量管加入0.05 L柠檬酸盐缓冲液后、0.025 L马铃薯酸性磷酸酶，在多管式旋涡混合器内混合均匀。进而放置在无光照直射的37.0 ℃室温环境中，孵育60 min，间隔手动振荡[2]。孵育完毕后，加入0.1 L灭菌水逐级稀释，在95.0 ℃水浴锅内振荡，在短时间内冷却至室内温度后过滤、无菌离心取上清液[3]。进而依据GB 5009.154—2016第二法，配制0 mg/100 g、0.002 mg/100 g、0.004 mg/100 g、0.006 mg/100 g、0.008 mg/100 g的标准品溶液。取微孔板条，在30.0 ℃无光照直射条件下孵育。孵育后，在Thermo酶标检测仪中，选择630 nm波长，进行吸光度读取[4]。
1.2.2 测定计算
GB 5009.154—2016第二法规定米粉中维生素B6含量需要依据下式进行计算：
式（1）中：X为维生素B6含量，C為样品在标准曲线下读取的浓度，n为稀释倍数，m为样品量[5]。其中维生素B6含量的相对标准不确定度为：
式（2）中：Urel（X）为维生素B6含量的相对标准不确定度，Urel（C）为样品在标准曲线下读取的浓度的标准不确定度，Urel（n）为稀释倍数的标准不确定度，Urel（m）为样品量的标准不确定度。
2 结果与分析
2.1 样品称量引入的不确定度
用电子天平精准称量样品2.500 1 g，天平精确度为0.1 mg。
由天平鉴定证书可知天平最大重复性误差为0.15 mg，在称取量大于0 g但小于50 g时，指示数值误差为0.1 mg。利用矩阵分布包含因子为k（）的B类不确定性标定，得出标准不确定度为0.1/=0.057 1，合成标准不确定式。则样品称量时的相对不确定度为0.080 75/2.500 1≈0.032 30。
2.2 样品稀释定容引入的不确定度
上述操作用仪器均为玻璃材质，玻璃材质校准、温度干扰均对液体体积具有影响，进而引发维生素B6测定偏差。根据最大允许误差，依据包含因子k为的均匀分布处理方法进行不确定度分量计算，可得出5 mL单标线吸量管最大允许误差为±0.015，不确定度为0.008 66，相对不确定度为0.001 68;而250 mL单标线容量瓶最大允许误差为±0.15，不确定度为0.086 6，相对不确定度为0.000 339，合成剥离器具校准引入的不确定度分量为。
考虑到微生物测定区域温度变化幅度在5.0 ℃左右，水膨胀系数为0.000 21 ℃，依据包含因子k为的矩形分布计算可知，因室温变化而引起的相对标准不确定度为
0.000 21×5/。合成温度变化引起的操作用仪器相对不确定度分量可得出结果为0.000 857 0，则样品稀释形容引入的不确定度就为。
2.3 样品测量中引入的不确定度
样品测量不确定性主要源于测量重复性。对定值样品中的维生素B6含量进行平行测定，测定次数为8，得出结果分别结果如表1所示。根据贝塞尔公式，计算得出标准不确定度，相对标准不确定度约等于0.000 363。则微生物法测定米粉中维生素B6的总不确定度为：0.032 30+0.087 034 2+0.000 363=0.119 697 2。
3 结论
微生物法测定米粉中维生素B6含量不确定度主要来源于样品称量、样品稀释定容、样品测量等几个环节，涉及了标准品纯度、天平自身精密度、移液器与容量瓶容差、样品测定重复性、试验环节温度变化等几个方面。测定人员应严格依据GB 5009.154—2016的要求，进行微生物法操作，为米粉安全监管提供充足支持。
参考文献
[1]罗彤，付文雯，黄坤，等.微生物法测定婴幼儿乳粉中维生素B12含量的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2021（1）：94-100.
[2]宋玉霞，田妮娜.微生物检定法测定乙酰螺旋霉素片含量的不确定度评定[J].中国医药指南，2017（34）：17-18.
[3]郭芯岐，张敏.微生物检定法测定注射用乳糖酸红霉素含量的不确定度评价[J].海峡药学，2017（4）：65-68.
[4]李芳，范孝英，赖梦书，等.微生物法测定鸡枞菌中叶酸含量不确定度评估[J].中国口岸科9学技术，2021（3）：16-20.
[5]商迎辉，章丽娜，李梦洁，等.微生物法测定婴幼儿配方食品中生物素的不确定度评估[J].中国食品学报，2019（10）：221-226.
关键词：微生物法;米粉;维生素B6;含量;不确定度
维生素B6又可称之为吡哆素，包括吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺等多个成分，可溶于水，参与人体多种代谢反应。维生素B6是米粉中重要营养组成之一，但因含量处于较低的水平，测定难度较大。《食品安全国家标准 食品中维生素B6的测定》（GB 5009.154—2016）规定了食品中维生素B6的含量测定方法，微生物法为标准第二法，适用于不同类别食品中维生素B6的测定。本文评估了利用GB 5009.154—2016第二法测定米粉中维生素B6含量的不确定度。
1 材料与方法
1.1 材料
SHP-250型生化培养箱、Thermo酶标检测仪、多管式旋涡混合器、水浴锅、0.2 μm无菌滤膜[1]。市售婴幼儿配方米粉、维生素B6标准品（≥99.0%），柠檬酸盐缓冲液（pH为4.5）、马铃薯酸性磷酸酶、无菌水。
1.2 实验方法
1.2.1 操作步骤
在250 mL锥形瓶内，放入2.5 g米粉样品，利用单标线吸量管加入0.05 L柠檬酸盐缓冲液后、0.025 L马铃薯酸性磷酸酶，在多管式旋涡混合器内混合均匀。进而放置在无光照直射的37.0 ℃室温环境中，孵育60 min，间隔手动振荡[2]。孵育完毕后，加入0.1 L灭菌水逐级稀释，在95.0 ℃水浴锅内振荡，在短时间内冷却至室内温度后过滤、无菌离心取上清液[3]。进而依据GB 5009.154—2016第二法，配制0 mg/100 g、0.002 mg/100 g、0.004 mg/100 g、0.006 mg/100 g、0.008 mg/100 g的标准品溶液。取微孔板条，在30.0 ℃无光照直射条件下孵育。孵育后，在Thermo酶标检测仪中，选择630 nm波长，进行吸光度读取[4]。
1.2.2 测定计算
GB 5009.154—2016第二法规定米粉中维生素B6含量需要依据下式进行计算：
式（1）中：X为维生素B6含量，C為样品在标准曲线下读取的浓度，n为稀释倍数，m为样品量[5]。其中维生素B6含量的相对标准不确定度为：
式（2）中：Urel（X）为维生素B6含量的相对标准不确定度，Urel（C）为样品在标准曲线下读取的浓度的标准不确定度，Urel（n）为稀释倍数的标准不确定度，Urel（m）为样品量的标准不确定度。
2 结果与分析
2.1 样品称量引入的不确定度
用电子天平精准称量样品2.500 1 g，天平精确度为0.1 mg。
由天平鉴定证书可知天平最大重复性误差为0.15 mg，在称取量大于0 g但小于50 g时，指示数值误差为0.1 mg。利用矩阵分布包含因子为k（）的B类不确定性标定，得出标准不确定度为0.1/=0.057 1，合成标准不确定式。则样品称量时的相对不确定度为0.080 75/2.500 1≈0.032 30。
2.2 样品稀释定容引入的不确定度
上述操作用仪器均为玻璃材质，玻璃材质校准、温度干扰均对液体体积具有影响，进而引发维生素B6测定偏差。根据最大允许误差，依据包含因子k为的均匀分布处理方法进行不确定度分量计算，可得出5 mL单标线吸量管最大允许误差为±0.015，不确定度为0.008 66，相对不确定度为0.001 68;而250 mL单标线容量瓶最大允许误差为±0.15，不确定度为0.086 6，相对不确定度为0.000 339，合成剥离器具校准引入的不确定度分量为。
考虑到微生物测定区域温度变化幅度在5.0 ℃左右，水膨胀系数为0.000 21 ℃，依据包含因子k为的矩形分布计算可知，因室温变化而引起的相对标准不确定度为
0.000 21×5/。合成温度变化引起的操作用仪器相对不确定度分量可得出结果为0.000 857 0，则样品稀释形容引入的不确定度就为。
2.3 样品测量中引入的不确定度
样品测量不确定性主要源于测量重复性。对定值样品中的维生素B6含量进行平行测定，测定次数为8，得出结果分别结果如表1所示。根据贝塞尔公式，计算得出标准不确定度，相对标准不确定度约等于0.000 363。则微生物法测定米粉中维生素B6的总不确定度为：0.032 30+0.087 034 2+0.000 363=0.119 697 2。
3 结论
微生物法测定米粉中维生素B6含量不确定度主要来源于样品称量、样品稀释定容、样品测量等几个环节，涉及了标准品纯度、天平自身精密度、移液器与容量瓶容差、样品测定重复性、试验环节温度变化等几个方面。测定人员应严格依据GB 5009.154—2016的要求，进行微生物法操作，为米粉安全监管提供充足支持。
参考文献
[1]罗彤，付文雯，黄坤，等.微生物法测定婴幼儿乳粉中维生素B12含量的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2021（1）：94-100.
[2]宋玉霞，田妮娜.微生物检定法测定乙酰螺旋霉素片含量的不确定度评定[J].中国医药指南，2017（34）：17-18.
[3]郭芯岐，张敏.微生物检定法测定注射用乳糖酸红霉素含量的不确定度评价[J].海峡药学，2017（4）：65-68.
[4]李芳，范孝英，赖梦书，等.微生物法测定鸡枞菌中叶酸含量不确定度评估[J].中国口岸科9学技术，2021（3）：16-20.
[5]商迎辉，章丽娜，李梦洁，等.微生物法测定婴幼儿配方食品中生物素的不确定度评估[J].中国食品学报，2019（10）：221-226.