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摘要 目的：探讨大蒜素诱导人子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡的作用机制。方法：分别以二甲基亚砜（空白对照组）、大蒜素（12.5、25、50 μg/mL）和LY294002 5 μg/mL干預对数生长期Ishikawa细胞。48 h后，用CCK-8法检测细胞增殖抑制率，流式细胞术分析细胞凋亡状况，Western Blotting法检测p-PI3K、p-AKT、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果：与空白对照组比较，经大蒜素12.5、25、50 μg/mL或LY294002 5 μg/mL干预能够提高Ishikawa细胞增殖抑制率和凋亡率;经大蒜素25、50 μg/mL或LY294002 5 μg/mL干预能够下调p-PI3K、p-AKT、Bcl-2表达并上调Cleaved Caspase-3、Bax表达，提高Bax/Bcl-2比值，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与LY294002组比较，经大蒜素50 μg/mL干预能够提高Ishikawa细胞增殖抑制率和凋亡率，下调p-PI3K、p-AKT表达并上调Cleaved Caspase-3、Bax表达，提高Bax/Bcl-2比值，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论：大蒜素能够诱导人子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡，可能与抑制PI3K/AKT信号通路活化而使其下游促凋亡蛋白表达上调有关。
关键词 大蒜素;子宫内膜癌;LY294002;Ishikawa细胞;增殖;凋亡;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B;机制
Abstract Objective：To investigate the effects and mechanism of Allicin on apoptosis of Ishikawa cells in human endometrial carcinoma.Methods：Ishikawa cells in logarithmic growth phase was treated with DMSO（blank control group），Allicin（12.5，25，50 μg/mL） and LY294002 5 μg/mL.48 h later，the cell proliferation inhibition rate was detected by CCK-8 method，cell apoptosis was analyzed by flow cytometry，and protein expression of p-PI3K，p-AKT，Cleaved Caspase-3，Bcl-2，and Bax were detected by Western blotting.Results：Compared with the blank control group，intervention of Allicin 12.5，25，50 μg/mL and LY294002 5μg/mL could increase Ishikawa cells proliferation inhibition rate and apoptosis rate，down-regulate the expression of p-PI3K，p-AKT，Bcl-2 and up-regulate the expression of Cleaved Caspase-3，Bax，increase the ratio of Bax/Bcl-2，all of which were statistically significant（P<0.05 or P<0.01）.Compared with the LY294002 5μg/mL group，intervented by Allicin 50 μg/mL could increase Ishikawa cells proliferation inhibition rate and apoptosis rate，down-regulate the expression of p-PI3K，p-AKT and up-regulate the expression of Caspase-3，Bax，increase the ratio of Bax/Bcl-2，all of which were statistically significant（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：Allicin can induce apoptosis of human endometrial cancer Ishikawa cells，which may be related to the inhibition of PI3K/AKT signaling pathway activation and up-regulation of downstream pro-apoptotic proteins.
Keywords Allicin; Endometrial cancer; LY294002; Ishikawa cells; Proliferation; Apoptosis; PI3K/AKT; Mechanism
中图分类号：R285.5;R273文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.011
子宫内膜癌是女性生殖系统常见的一种恶性上皮肿瘤，发病率仅次于宫颈癌居第2位，晚期患者5年生存率不足50%[1]。并且随着肥胖、糖尿病等高危人群的增加，子宫内膜癌发病率呈逐年上升且年轻化趋势，严重威胁着女性的生命健康[2]。
大蒜素是天然存在于大蒜鳞茎中的一种二烯丙基三硫化物，具有抗炎、抗氧化以及广泛的抗肿瘤活性[3-6]。本研究发现大蒜素能够抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长并增强其顺铂化疗敏感性[7-8]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路对细胞增殖和抗凋亡具有关键的调控作用[9-11]，本研究以Ishikawa细胞为受试细胞，探讨大蒜素对子宫内膜癌细胞凋亡的影响以及PI3K/AKT信号通路在其中发挥的作用。 2.4 各组人子宫内膜癌Ishikawa细胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达检测结果 与空白对照组比较，大蒜素25、50 μg/mL组和LY294002 5 μg/mL组Ishikawa细胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著上调而Bcl-2表达显著下调（P<0.05或P<0.01）;与LY294002 5 μg/mL组比较，大蒜素50 μg/mL组Cleaved Caspase-3、Bax表达显著上调（P<0.01），2组Bcl-2表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图3，表3。
3 讨论
目前，手术切除并辅以放化疗仍是临床治疗子宫内膜癌的首选方案，然而化疗药物不良反应显著并易形成耐药性，从而导致复发和病灶转移[12]。病理生理学研究发现，子宫内膜癌疾病进展与癌细胞异常增殖和凋亡抑制密切相关，因此以诱导癌细胞凋亡为靶点开发新型抗癌药物，或许对改善子宫内膜癌患者生命质量、延长生存期具有重要意义。
近年来，中医药在肿瘤治疗中越来越受重视，大蒜为百合科葱属植物，其鳞茎可入药，性温，味辛、甘，具有温中健胃、消食理气之功效。大蒜素是大蒜鳞茎的主要活性成分，具有广泛的抗肿瘤活性，能够促进人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞、人白血病HL-60细胞、大肠癌Lovo细胞凋亡[13-15]。本实验以人子宫内膜癌Ishikawa细胞为受试细胞，研究发现经大蒜素或LY294002干预能够显著提高Ishikawa细胞增殖抑制率和凋亡率，提示大蒜素具有诱导人子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡并抑制其增殖的作用。
细胞凋亡是一种程序化细胞死亡过程，该过程有多种基因蛋白参与调控，其中Caspase家族和Bcl-2家族蛋白发挥着重要调控作用。Caspase-3被细胞色素C激活后参与细胞凋亡的启动和执行过程，是凋亡级联反应最关键的促凋亡蛋白酶[16]。Bcl-2家族蛋白可分为抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白两大类，其中Bcl-2是位于线粒体膜上的一种膜蛋白，能够通过调控线粒体膜通透性而抑制细胞色素C释放，抑制Caspase-3活化、抑制Ca2+超载等而发挥抗凋亡作用;Bax则能够与Bcl-2形成异源二聚体而抑制其抗凋亡活性，并且能够破坏线粒体膜的完整性而導致细胞色素C的释放，激活Caspase-3而诱导细胞凋亡[17]。
PI3K/AKT信号通路在细胞凋亡的调控中发挥着重要作用，AKT是PI3K下游信号分子和靶激酶，p-PI3K能够促进AKT发生磷酸化（p-AKT）而被激活，p-AKT诱导具有促凋亡作用的糖原合成酶激酶-3β磷酸化而失活，能够抑制Caspase-3活化而抗凋亡，并且p-AKT能够抑制促凋亡蛋白Bax的合成[18-20]。本研究发现，经大蒜素或LY294002干预能够有效下调人子宫内膜癌Ishikawa细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达，上调Cleaved Caspase-3、Bax蛋白并下调Bcl-2表达，并且大蒜素50 μg/mL对p-PI3K、p-AKT、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达的调控作用优于LY294002 5 μg/mL。
综上所述，大蒜素能够诱导人子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡，机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路活化而使其下游促凋亡蛋白表达上调有关。
参考文献
[1]赵祎琪，邓泽文，郄明蓉，等.226例晚期子宫内膜癌的临床病理特征及治疗与其预后的相关因素分析[J].实用妇产科杂志，2017，33（7）：506-511.
[2]Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2018[J].CA Cancer J Clin，2018，68（1）：7-30.
[3]沈德新，李庆华，孙荣青，等.大蒜素对重症中暑大鼠炎性介质和氧化应激及脏器功能的影响[J].中国医药导报，2019，16（19）：25-28.
[4]杨雅楠.大蒜素对慢性肾衰大鼠氧化应激和炎症反应的影响[J].实用药物与临床，2018，21（1）：24-28.
[5]焦存，芦现杰，谷万里.大蒜素抗妇科恶性肿瘤机制的研究进展[J].现代中西医结合杂志，2019，28（2）：222-225.
[6]傅荣萍，刘玉萍，张毕桥，等.大蒜素二烯丙基三硫醚微乳的制备及其对肿瘤细胞增殖与迁移的影响[J].中草药，2018，49（23）：5541-5547.
[7]贾丽.大蒜素抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长的实验研究[J].医学研究杂志，2017，46（2）：127-130.
[8]贾丽.大蒜素对子宫内膜癌细胞顺铂增敏作用及机制的实验研究[J].世界中西医结合杂志，2018，13（7）：934-937.
[9]张明府，陈浩.AFAP1-AS1对结肠癌细胞增殖、凋亡和PI3K/Akt信号通路的影响[J].临床肿瘤学杂志，2020，25（9）：803-808.
[10]王书惠，尹秀艳，刘海英，等.紫草素通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡和自噬[J].中国病理生理杂志，2019，35（7）：1189-1194.
[11]王健，李健，王勇，等.黄芩素通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路诱导膀胱癌细胞凋亡[J].山东大学学报：医学版，2019，57（9）：74-82.
[12]蒋蕾，严浩，黄奕，等.子宫内膜癌手术治疗预后的影响因素分析[J].解放军预防医学杂志，2019，37（10）：136-137，139.
[13]郭燕军.大蒜素对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞生长的影响[J].西部中医药，2019，32（2）：25-28.
[14]熊春雷，姚青林，冯品，等.大蒜素诱导人白血病HL-60细胞程序性坏死及分子机制的研究[J].现代生物医学进展，2017，17（35）：6833-6838.
[15]李学文，郭为钧.大蒜素通过AKT/NF-κB通路诱导大肠癌细胞凋亡的实验研究[J].现代消化及介入诊疗，2020，25（2）：193-198.
[16]刘蓉芳，毛以林，谭雄，等.心康冲剂改善慢性心衰模型大鼠心肌凋亡及调控Caspase-3/9的表达[J].湖南中医药大学学报，2019，39（8）：948-951.
[17]Zhu L，Hao J，Cheng M，et al.Hyperglycemia-induced Bcl-2/Bax-mediated apoptosis of Schwann cells via mTORC1/S6K1 inhibition in diabetic peripheral neuropathy[J].Exp Cell Res，2018，367（2）：186-195.
[18]Justin-Thenmozhi A，Dhivya Bharathi M，Kiruthika R，et al.Attenuation of aluminum chloride-induced neuroinflammation and caspase activation through the AKT/GSK-3β pathway by hesperidin in wistar rats[J].Neurotox Res，2018，34（3）：463-476.
[19]陈裕琳，万海同，周惠芬，虞立，何昱，李畅，程兰，杨洁红.丹参与红花有效成分配伍对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中草药，2018，49（16）：3875-3881.
[20]郑世勤，王晓松，陈双，等.大蒜素对TGF-β1诱导人胆管癌细胞上皮间质化的影响及机制[J].医学研究生学报，2019，32（2）：143-147.
（2020-06-04收稿 责任编辑：张雄杰）
关键词 大蒜素;子宫内膜癌;LY294002;Ishikawa细胞;增殖;凋亡;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B;机制
Abstract Objective：To investigate the effects and mechanism of Allicin on apoptosis of Ishikawa cells in human endometrial carcinoma.Methods：Ishikawa cells in logarithmic growth phase was treated with DMSO（blank control group），Allicin（12.5，25，50 μg/mL） and LY294002 5 μg/mL.48 h later，the cell proliferation inhibition rate was detected by CCK-8 method，cell apoptosis was analyzed by flow cytometry，and protein expression of p-PI3K，p-AKT，Cleaved Caspase-3，Bcl-2，and Bax were detected by Western blotting.Results：Compared with the blank control group，intervention of Allicin 12.5，25，50 μg/mL and LY294002 5μg/mL could increase Ishikawa cells proliferation inhibition rate and apoptosis rate，down-regulate the expression of p-PI3K，p-AKT，Bcl-2 and up-regulate the expression of Cleaved Caspase-3，Bax，increase the ratio of Bax/Bcl-2，all of which were statistically significant（P<0.05 or P<0.01）.Compared with the LY294002 5μg/mL group，intervented by Allicin 50 μg/mL could increase Ishikawa cells proliferation inhibition rate and apoptosis rate，down-regulate the expression of p-PI3K，p-AKT and up-regulate the expression of Caspase-3，Bax，increase the ratio of Bax/Bcl-2，all of which were statistically significant（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：Allicin can induce apoptosis of human endometrial cancer Ishikawa cells，which may be related to the inhibition of PI3K/AKT signaling pathway activation and up-regulation of downstream pro-apoptotic proteins.
Keywords Allicin; Endometrial cancer; LY294002; Ishikawa cells; Proliferation; Apoptosis; PI3K/AKT; Mechanism
中图分类号：R285.5;R273文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.011
子宫内膜癌是女性生殖系统常见的一种恶性上皮肿瘤，发病率仅次于宫颈癌居第2位，晚期患者5年生存率不足50%[1]。并且随着肥胖、糖尿病等高危人群的增加，子宫内膜癌发病率呈逐年上升且年轻化趋势，严重威胁着女性的生命健康[2]。
大蒜素是天然存在于大蒜鳞茎中的一种二烯丙基三硫化物，具有抗炎、抗氧化以及广泛的抗肿瘤活性[3-6]。本研究发现大蒜素能够抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长并增强其顺铂化疗敏感性[7-8]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路对细胞增殖和抗凋亡具有关键的调控作用[9-11]，本研究以Ishikawa细胞为受试细胞，探讨大蒜素对子宫内膜癌细胞凋亡的影响以及PI3K/AKT信号通路在其中发挥的作用。 2.4 各组人子宫内膜癌Ishikawa细胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达检测结果 与空白对照组比较，大蒜素25、50 μg/mL组和LY294002 5 μg/mL组Ishikawa细胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著上调而Bcl-2表达显著下调（P<0.05或P<0.01）;与LY294002 5 μg/mL组比较，大蒜素50 μg/mL组Cleaved Caspase-3、Bax表达显著上调（P<0.01），2组Bcl-2表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图3，表3。
3 讨论
目前，手术切除并辅以放化疗仍是临床治疗子宫内膜癌的首选方案，然而化疗药物不良反应显著并易形成耐药性，从而导致复发和病灶转移[12]。病理生理学研究发现，子宫内膜癌疾病进展与癌细胞异常增殖和凋亡抑制密切相关，因此以诱导癌细胞凋亡为靶点开发新型抗癌药物，或许对改善子宫内膜癌患者生命质量、延长生存期具有重要意义。
近年来，中医药在肿瘤治疗中越来越受重视，大蒜为百合科葱属植物，其鳞茎可入药，性温，味辛、甘，具有温中健胃、消食理气之功效。大蒜素是大蒜鳞茎的主要活性成分，具有广泛的抗肿瘤活性，能够促进人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞、人白血病HL-60细胞、大肠癌Lovo细胞凋亡[13-15]。本实验以人子宫内膜癌Ishikawa细胞为受试细胞，研究发现经大蒜素或LY294002干预能够显著提高Ishikawa细胞增殖抑制率和凋亡率，提示大蒜素具有诱导人子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡并抑制其增殖的作用。
细胞凋亡是一种程序化细胞死亡过程，该过程有多种基因蛋白参与调控，其中Caspase家族和Bcl-2家族蛋白发挥着重要调控作用。Caspase-3被细胞色素C激活后参与细胞凋亡的启动和执行过程，是凋亡级联反应最关键的促凋亡蛋白酶[16]。Bcl-2家族蛋白可分为抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白两大类，其中Bcl-2是位于线粒体膜上的一种膜蛋白，能够通过调控线粒体膜通透性而抑制细胞色素C释放，抑制Caspase-3活化、抑制Ca2+超载等而发挥抗凋亡作用;Bax则能够与Bcl-2形成异源二聚体而抑制其抗凋亡活性，并且能够破坏线粒体膜的完整性而導致细胞色素C的释放，激活Caspase-3而诱导细胞凋亡[17]。
PI3K/AKT信号通路在细胞凋亡的调控中发挥着重要作用，AKT是PI3K下游信号分子和靶激酶，p-PI3K能够促进AKT发生磷酸化（p-AKT）而被激活，p-AKT诱导具有促凋亡作用的糖原合成酶激酶-3β磷酸化而失活，能够抑制Caspase-3活化而抗凋亡，并且p-AKT能够抑制促凋亡蛋白Bax的合成[18-20]。本研究发现，经大蒜素或LY294002干预能够有效下调人子宫内膜癌Ishikawa细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达，上调Cleaved Caspase-3、Bax蛋白并下调Bcl-2表达，并且大蒜素50 μg/mL对p-PI3K、p-AKT、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达的调控作用优于LY294002 5 μg/mL。
综上所述，大蒜素能够诱导人子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡，机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路活化而使其下游促凋亡蛋白表达上调有关。
参考文献
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[16]刘蓉芳，毛以林，谭雄，等.心康冲剂改善慢性心衰模型大鼠心肌凋亡及调控Caspase-3/9的表达[J].湖南中医药大学学报，2019，39（8）：948-951.
[17]Zhu L，Hao J，Cheng M，et al.Hyperglycemia-induced Bcl-2/Bax-mediated apoptosis of Schwann cells via mTORC1/S6K1 inhibition in diabetic peripheral neuropathy[J].Exp Cell Res，2018，367（2）：186-195.
[18]Justin-Thenmozhi A，Dhivya Bharathi M，Kiruthika R，et al.Attenuation of aluminum chloride-induced neuroinflammation and caspase activation through the AKT/GSK-3β pathway by hesperidin in wistar rats[J].Neurotox Res，2018，34（3）：463-476.
[19]陈裕琳，万海同，周惠芬，虞立，何昱，李畅，程兰，杨洁红.丹参与红花有效成分配伍对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中草药，2018，49（16）：3875-3881.
[20]郑世勤，王晓松，陈双，等.大蒜素对TGF-β1诱导人胆管癌细胞上皮间质化的影响及机制[J].医学研究生学报，2019，32（2）：143-147.
（2020-06-04收稿 责任编辑：张雄杰）