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摘要：从羽毛加工厂污泥中分离到一株嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia ）YHYJ-1，对羽毛、羊毛和毛发底物均具有降解作用。菌株YHYJ-1对不同底物的降解能力存在差异，培养36 h羽毛完全降解，羊毛降解时间是72 h，毛发则在84 h有部分降解作用。分别以可溶性羽毛角蛋白、羽毛粉和偶氮角蛋白为底物进行酶活测定，以最高酶活值设定为100%，3种底物的相对酶活分别为100%、651%和232%，表明菌株YHYJ-1角蛋白酶的最适底物为可溶性角蛋白。菌株YHYJ-1接种于羽毛粉培养基， 培养20 h后角蛋白酶活性急剧升高，28 h酶活达最大值，之后快速下降。
关键词：嗜麦芽窄食单胞菌；羽毛；角蛋白质；角蛋白酶
中图分类号：Q9399文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0096-04
角蛋白质是广泛存在于羽毛、毛发、鳞片、蹄、角等组织中的硬性蛋白，是一类具有巨大潜在应用价值的废弃蛋白质资源。角蛋白含有大量高度交联的二硫键结构，不易被一般的蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解[1]，限制了其应用。角蛋白分为α-角蛋白和β-角蛋白两种。α-角蛋白是毛发的主要构成组分，β-角蛋白多见于羽毛中[2]。角蛋白可被微生物分泌的角蛋白酶降解。不同种类微生物产生的角蛋白酶性能存在差异，特别表现于底物特性不同。角蛋白酶底物特性是研究微生物降解角蛋白质降解机理的基础。
角蛋白不溶于水及大部分有机溶剂，其活性测定比一般蛋白酶困难。目前测定角蛋白酶的方法主要有3种，一是直接用角蛋白粉（羽毛粉）作为底物[3]；二是使用经过修饰的底物偶氮角蛋白[4]或天青角蛋白[5]；三是以可溶性羽毛角蛋白作为底物[6]。
本实验室从羽毛加工厂污泥中分离到一株高效降解角蛋白质的嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1，并研究了该菌株YHYJ–1的底物特异性，筛选出了最佳酶活测定方法，测定了菌株产角蛋白酶变化曲线，为深入研究其降解角蛋白质的机理提供了依据。
1材料与方法
11供试菌株与材料
嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia） YHYJ-1，山东省农业科学院高新技术研究中心微生物实验室保存。
羽毛及羽毛粉：从肉鸡屠宰厂取鸡毛，洗涤剂漂洗，自来水冲洗后121℃高压灭菌25 min，再用蒸馏水充分洗净，80℃烘干。羽毛球磨粉碎过100目筛即羽毛粉。
羊毛与毛发：羊毛来自山东省农业科学院肉羊养殖厂，毛发来自理发店。自来水清洗，烘至恒重。
羽毛/羊毛/毛发培养基（1 000 ml）：NaCl 05 g，MgCl2 01 g，CaCl2 006 g，KH2PO4 07 g，K2HPO4 14 g，羽毛/羊毛/毛发5 g。
羽毛粉培养基（1 000 ml）：NaCl 05 g，MgCl2 01 g，CaCl2 006 g，KH2PO4 07 g，K2HPO4 14 g，羽毛粉10 g。
12角蛋白酶底物特异性
在羽毛、羊毛和毛发培养基上接种1%的YHYJ-1菌株培养液，37℃、180 r/min培养，观察YHYJ-1菌株对3种底物的降解情况。
菌株发酵液蛋白含量测定：采用Bradford（1976）[7]的方法进行蛋白质浓度测定，以牛血清白蛋白作为标准蛋白。菌株YHYJ-1接种于羽毛、羊毛及毛发培养基中，每12 h取样1次，测定蛋白质含量。
13角蛋白酶活性测定方法
角蛋白粗酶液的制备：以1%的接种量接种于羽毛粉培养基，37℃、180 r/min培养24 h。4℃、12 000 r/min离心10 min，上清即为角蛋白粗酶液。
可溶性角蛋白、羽毛粉为底物的酶活测定方法参照Vermelho（2010）[8]的方法并加以改进：300 μl酶液加300 μl 06%可溶性角蛋白（羽毛粉）底物，50℃水浴反应30 min后加入300 μl 04 mol/L TCA终止反应。并以10 000 r/min离心10 min，于280 nm处测定吸光度。空白实验条件同实验组，在加角蛋白粗酶液前加300 μl 04 mol/L TCA提前终止反应。酶活性单位（U）定义为：混合液反应30 min后在280 nm的OD值比对照升高001定义为1 U。
偶氮角蛋白为底物的酶活测定方法参照Lin （1992）[4]的方法。酶活性单位（U）定义为：混合液反应30 min后在595 nm的OD值比对照升高001定义为1 U。
可溶性角蛋白的制备参照Wawrzkiewicz（1987）[6]的方法略有改动：剪去羽毛羽轴，加入甲醇∶氯仿（体积比1∶1）中，37℃放置30 min脱脂；脱脂的羽毛放入肥皂水中，42℃浸泡12 h；蒸馏水洗涤羽毛，40℃烘干；称取5 g烘干的羽毛，加入500 ml二甲基亚砜，100℃回流浸提2 h；加入2倍体积冷的丙酮沉淀角蛋白，-20℃放置24 h；8 000 r/min离心5 min，弃上清；用冷的丙酮洗两次后用蒸馏水洗两次；40℃烘干后，研成粉末即为可溶性角蛋白。
14嗜麦芽窄食单胞菌发酵产酶试验
利用瑞士产KLF2000型全自动发酵罐研究菌株产酶性能。羽毛粉培养基，装量26L/37L，接种量1%。培养条件为37℃，980 r/min。每4 h取样1次，离心后测定发酵液酶活性，绘制嗜麦芽窄食单胞菌产酶曲线。
2结果与分析
21角蛋白酶底物特异性
以羽毛、羊毛和毛发为唯一碳氮源研究嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1的底物利用特性。结果表明，YHYJ-1菌株对羽毛的降解最快，培养24 h后除羽轴外全部降解，36 h后包括羽轴在内全部降解。菌株对羊毛的降解相对较慢，36 h后羊毛开始断裂，有明显降解。72 h后，羊毛全部降解。菌株对毛发的降解最为缓慢，48 h后始发现培养基有浑浊现象，84 h后毛发出现断裂降解现象，但继续培养未发现进一步降解（图1）。 22发酵液蛋白质含量
发酵液可溶性蛋白质含量变化反映了菌株对角蛋白质的降解情况。结果表明，各底物处理随培养时间延长，培养液蛋白质含量均呈上升趋势，但底物间差异明显。以羽毛为底物培养液蛋白质含量12 h内快速升高，24 h后进入平稳期，60 h后蛋白含量呈缓慢下降趋势。以羊毛为底物时，培养液蛋白质含量0～48 h持续升高，之后进入平稳期并维持较高含量水平。以毛发为底物培养液蛋白质含量增加缓慢，且水平明显低于羽毛和毛发底物处理，说明菌株对毛发的降解能力相对较弱（图2）。23酶活测定方法研究
分别以可溶性角蛋白、偶氮角蛋白和羽毛粉为底物，测定培养液角蛋白酶活性，以最高酶活为100%。结果表明，以可溶性角蛋白为底物酶活最高（100%），其次为羽毛粉底物（为可溶性角蛋白底物的651%），偶氮角蛋白底物的酶活仅为可溶性角蛋白底物的232%。测定过程还发现，以羽毛粉做底物的测定结果不稳定，不适合作为底物。上述结果表明，研究嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1的角蛋白酶特性的最适宜底物为可溶性角蛋白质。
24嗜麦芽窄食单胞菌发酵产酶曲线
以羽毛粉为底物对嗜麦芽窄食单胞菌进行发酵，接种培养20 h后角蛋白酶活性快速升高，28 h达到最大值，之后急剧下降，48 h后酶活降到很低水平（图3）。
嗜麦芽窄食假单胞菌属于革兰氏阴性原核微生物，大都为条件致病菌，限制了其应用。现代分子生物学技术注重高效功能基因资源的研究与开发，近年来已有关于嗜麦芽窄食假单胞菌产蛋白酶及降解羽毛功能的报道[9～11]。本实验室分离到一株能在36 h内完全降解羽毛的嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1，其效率远高于之前的文献报道[1，12～14]。研究表明，菌株YHYJ-1对羽毛、羊毛和毛发底物均具有降解作用，但不同底物间的降解能力存在差异。该菌株能在培养36 h完全降解羽毛，对羊毛的降解时间为72 h，毛发底物则在84 h有部分降解作用，显示了其对羽毛角蛋白的高效降解功能。为研究菌株YHYJ-1的角蛋白酶性能，分别以可溶性角蛋白、偶氮角蛋白和羽毛粉为底物测定其活性，从而确定了该菌株产生角蛋白酶的最适底物为可溶性角蛋白 。对菌株YHYJ-1产角蛋白酶变化研究表明，羽毛粉培养基中接种培养28 h角蛋白酶活性达最高值 ，酶活性随时间推移，菌株降解羽毛的进程加快，发酵液可溶性蛋白质含量增加，且变化趋势一致 。表明嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1降解羽毛角蛋白质机理主要是角蛋白酶作用。上述研究结果对研究嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1降解角蛋白质机理提供了理论基础。参考文献：
[1]Williams C M， Richter C S， MacKenzie J M， et al Isolation， identification， and characterization of a feather-degrading bacterium [J] Applied Enviorn Microbiol， 1990， 56（6）：1509-1515
[2]Parry D A， North A C Hard α–keratin intermediate filament chains： suvstructure of the N- and C-terminal domains and the predicted structure and function of the C-terminal domains of type I and type II chains[J] Journal of Structural Biology， 1998， 122（1-2）：279-290
[3]涂国全，孙宇晖，郭美锦，等.链霉菌分解角蛋白的生化机制研究[J].江西农业大学学报，1998，20（2）：164-169.
[4]Lin X， Lee C G， Casale E S， et al Purification and characterization of a keratinase from a feather-degrading Bacillus lieheniformis strain[J] Appl Environ Microbiol， 1992， 58（10）： 3271-3275
[5]Suntornsuk W， Suntornsuk L Feather degradation by Bacillus sp FK 46 in submerged cultivation[J] Bioresource Teehnol， 2003， 86（3）：239-243
[6]Wawrzkiewicz K， Lobarzewski J， Wolski T Intracellular keratinase of Trichophyton gallinae[J] J Med Vet Mycol， 1987， 25： 261-268
[7]Bradford M M A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutlizing the principle of protein-dye binding[J] Analytical Biochemistry， 1976， 72：248-254
[8]Vermelho A B， Mazotto A M，de Melo A C， et al Identification of a Candida parapsilosis strain producing extracellular serine peptidase with keratinolytic activity[J] Mycopathologia， 2010， 169（1）： 57-65 [9]Windhorst S， Frank E， Georgieva D N， et al The major extracellular protease of the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia： characterization of the protein and molecular cloning of the gene[J] J l Bio Chem， 2002， 277 （13）： 11042-11049
[10]Cao Z J， Zhang Q， Wei D K， et al Characterization of a novel Stenotrophomonas isolate with high keratinase activity and purification of the enzyme[J] J Ind MicrobiolBiotechnol， 2009， 36（2）： 181-188
[11]DeToni C H， Richter M F， Chagas J R， et al Purification and characterization of an alkaline serine endopeptidase from a feather-degrading Xanthomonas maltophilia strain[J] Can J Microbiol， 2002， 48（4）： 342-348
[12]Cai C G， Ceng G S， Qi J J， et al Purification and chracterization of keratinase from a new Bacillus subtilis strain[J] J Zhejiang Univ Sci B， 2008， 9 （9）： 713-720
[13]Thys R C， Lucas F S， Riffel1 A， et al Characterization of a protease of a feather-degrading Microbacterium species[J] Letters in Applied Microbiology， 2004， 39（2）： 181-186
[14 ]Sangali S， Brandelli A Isolation and characterized of a novel feather-degrading bacterial strain [J]App Biochem Biotech， 2000，87（1）：17-24山 东 农 业 科 学2013，45（1）：100～103，106Shandong Agricultural Sciences
关键词：嗜麦芽窄食单胞菌；羽毛；角蛋白质；角蛋白酶
中图分类号：Q9399文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0096-04
角蛋白质是广泛存在于羽毛、毛发、鳞片、蹄、角等组织中的硬性蛋白，是一类具有巨大潜在应用价值的废弃蛋白质资源。角蛋白含有大量高度交联的二硫键结构，不易被一般的蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解[1]，限制了其应用。角蛋白分为α-角蛋白和β-角蛋白两种。α-角蛋白是毛发的主要构成组分，β-角蛋白多见于羽毛中[2]。角蛋白可被微生物分泌的角蛋白酶降解。不同种类微生物产生的角蛋白酶性能存在差异，特别表现于底物特性不同。角蛋白酶底物特性是研究微生物降解角蛋白质降解机理的基础。
角蛋白不溶于水及大部分有机溶剂，其活性测定比一般蛋白酶困难。目前测定角蛋白酶的方法主要有3种，一是直接用角蛋白粉（羽毛粉）作为底物[3]；二是使用经过修饰的底物偶氮角蛋白[4]或天青角蛋白[5]；三是以可溶性羽毛角蛋白作为底物[6]。
本实验室从羽毛加工厂污泥中分离到一株高效降解角蛋白质的嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1，并研究了该菌株YHYJ–1的底物特异性，筛选出了最佳酶活测定方法，测定了菌株产角蛋白酶变化曲线，为深入研究其降解角蛋白质的机理提供了依据。
1材料与方法
11供试菌株与材料
嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia） YHYJ-1，山东省农业科学院高新技术研究中心微生物实验室保存。
羽毛及羽毛粉：从肉鸡屠宰厂取鸡毛，洗涤剂漂洗，自来水冲洗后121℃高压灭菌25 min，再用蒸馏水充分洗净，80℃烘干。羽毛球磨粉碎过100目筛即羽毛粉。
羊毛与毛发：羊毛来自山东省农业科学院肉羊养殖厂，毛发来自理发店。自来水清洗，烘至恒重。
羽毛/羊毛/毛发培养基（1 000 ml）：NaCl 05 g，MgCl2 01 g，CaCl2 006 g，KH2PO4 07 g，K2HPO4 14 g，羽毛/羊毛/毛发5 g。
羽毛粉培养基（1 000 ml）：NaCl 05 g，MgCl2 01 g，CaCl2 006 g，KH2PO4 07 g，K2HPO4 14 g，羽毛粉10 g。
12角蛋白酶底物特异性
在羽毛、羊毛和毛发培养基上接种1%的YHYJ-1菌株培养液，37℃、180 r/min培养，观察YHYJ-1菌株对3种底物的降解情况。
菌株发酵液蛋白含量测定：采用Bradford（1976）[7]的方法进行蛋白质浓度测定，以牛血清白蛋白作为标准蛋白。菌株YHYJ-1接种于羽毛、羊毛及毛发培养基中，每12 h取样1次，测定蛋白质含量。
13角蛋白酶活性测定方法
角蛋白粗酶液的制备：以1%的接种量接种于羽毛粉培养基，37℃、180 r/min培养24 h。4℃、12 000 r/min离心10 min，上清即为角蛋白粗酶液。
可溶性角蛋白、羽毛粉为底物的酶活测定方法参照Vermelho（2010）[8]的方法并加以改进：300 μl酶液加300 μl 06%可溶性角蛋白（羽毛粉）底物，50℃水浴反应30 min后加入300 μl 04 mol/L TCA终止反应。并以10 000 r/min离心10 min，于280 nm处测定吸光度。空白实验条件同实验组，在加角蛋白粗酶液前加300 μl 04 mol/L TCA提前终止反应。酶活性单位（U）定义为：混合液反应30 min后在280 nm的OD值比对照升高001定义为1 U。
偶氮角蛋白为底物的酶活测定方法参照Lin （1992）[4]的方法。酶活性单位（U）定义为：混合液反应30 min后在595 nm的OD值比对照升高001定义为1 U。
可溶性角蛋白的制备参照Wawrzkiewicz（1987）[6]的方法略有改动：剪去羽毛羽轴，加入甲醇∶氯仿（体积比1∶1）中，37℃放置30 min脱脂；脱脂的羽毛放入肥皂水中，42℃浸泡12 h；蒸馏水洗涤羽毛，40℃烘干；称取5 g烘干的羽毛，加入500 ml二甲基亚砜，100℃回流浸提2 h；加入2倍体积冷的丙酮沉淀角蛋白，-20℃放置24 h；8 000 r/min离心5 min，弃上清；用冷的丙酮洗两次后用蒸馏水洗两次；40℃烘干后，研成粉末即为可溶性角蛋白。
14嗜麦芽窄食单胞菌发酵产酶试验
利用瑞士产KLF2000型全自动发酵罐研究菌株产酶性能。羽毛粉培养基，装量26L/37L，接种量1%。培养条件为37℃，980 r/min。每4 h取样1次，离心后测定发酵液酶活性，绘制嗜麦芽窄食单胞菌产酶曲线。
2结果与分析
21角蛋白酶底物特异性
以羽毛、羊毛和毛发为唯一碳氮源研究嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1的底物利用特性。结果表明，YHYJ-1菌株对羽毛的降解最快，培养24 h后除羽轴外全部降解，36 h后包括羽轴在内全部降解。菌株对羊毛的降解相对较慢，36 h后羊毛开始断裂，有明显降解。72 h后，羊毛全部降解。菌株对毛发的降解最为缓慢，48 h后始发现培养基有浑浊现象，84 h后毛发出现断裂降解现象，但继续培养未发现进一步降解（图1）。 22发酵液蛋白质含量
发酵液可溶性蛋白质含量变化反映了菌株对角蛋白质的降解情况。结果表明，各底物处理随培养时间延长，培养液蛋白质含量均呈上升趋势，但底物间差异明显。以羽毛为底物培养液蛋白质含量12 h内快速升高，24 h后进入平稳期，60 h后蛋白含量呈缓慢下降趋势。以羊毛为底物时，培养液蛋白质含量0～48 h持续升高，之后进入平稳期并维持较高含量水平。以毛发为底物培养液蛋白质含量增加缓慢，且水平明显低于羽毛和毛发底物处理，说明菌株对毛发的降解能力相对较弱（图2）。23酶活测定方法研究
分别以可溶性角蛋白、偶氮角蛋白和羽毛粉为底物，测定培养液角蛋白酶活性，以最高酶活为100%。结果表明，以可溶性角蛋白为底物酶活最高（100%），其次为羽毛粉底物（为可溶性角蛋白底物的651%），偶氮角蛋白底物的酶活仅为可溶性角蛋白底物的232%。测定过程还发现，以羽毛粉做底物的测定结果不稳定，不适合作为底物。上述结果表明，研究嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1的角蛋白酶特性的最适宜底物为可溶性角蛋白质。
24嗜麦芽窄食单胞菌发酵产酶曲线
以羽毛粉为底物对嗜麦芽窄食单胞菌进行发酵，接种培养20 h后角蛋白酶活性快速升高，28 h达到最大值，之后急剧下降，48 h后酶活降到很低水平（图3）。
嗜麦芽窄食假单胞菌属于革兰氏阴性原核微生物，大都为条件致病菌，限制了其应用。现代分子生物学技术注重高效功能基因资源的研究与开发，近年来已有关于嗜麦芽窄食假单胞菌产蛋白酶及降解羽毛功能的报道[9～11]。本实验室分离到一株能在36 h内完全降解羽毛的嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1，其效率远高于之前的文献报道[1，12～14]。研究表明，菌株YHYJ-1对羽毛、羊毛和毛发底物均具有降解作用，但不同底物间的降解能力存在差异。该菌株能在培养36 h完全降解羽毛，对羊毛的降解时间为72 h，毛发底物则在84 h有部分降解作用，显示了其对羽毛角蛋白的高效降解功能。为研究菌株YHYJ-1的角蛋白酶性能，分别以可溶性角蛋白、偶氮角蛋白和羽毛粉为底物测定其活性，从而确定了该菌株产生角蛋白酶的最适底物为可溶性角蛋白 。对菌株YHYJ-1产角蛋白酶变化研究表明，羽毛粉培养基中接种培养28 h角蛋白酶活性达最高值 ，酶活性随时间推移，菌株降解羽毛的进程加快，发酵液可溶性蛋白质含量增加，且变化趋势一致 。表明嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1降解羽毛角蛋白质机理主要是角蛋白酶作用。上述研究结果对研究嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1降解角蛋白质机理提供了理论基础。参考文献：
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[10]Cao Z J， Zhang Q， Wei D K， et al Characterization of a novel Stenotrophomonas isolate with high keratinase activity and purification of the enzyme[J] J Ind MicrobiolBiotechnol， 2009， 36（2）： 181-188
[11]DeToni C H， Richter M F， Chagas J R， et al Purification and characterization of an alkaline serine endopeptidase from a feather-degrading Xanthomonas maltophilia strain[J] Can J Microbiol， 2002， 48（4）： 342-348
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[14 ]Sangali S， Brandelli A Isolation and characterized of a novel feather-degrading bacterial strain [J]App Biochem Biotech， 2000，87（1）：17-24山 东 农 业 科 学2013，45（1）：100～103，106Shandong Agricultural Sciences