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摘要测定清开灵注射液、清开灵颗粒中黄芩苷的含量方法。方法:高效液相色谱法,色谱柱为:Kromasil C18 (4.6mm×150mm,5um);流动相为甲醇-水-磷酸(60:40:0.2);检测波长280nm;流速1.0ml/min;柱温为30℃。结果:黄芩苷对照品溶液在25-200ug/ml范围内呈良好的线性关系(r=0.9995),精密度,重复性,稳定性及加样回收率结果均可满足分析的要求。结论 该法快捷、简便、准确性高. 为中药复方制剂提供了更加简便,合理,可靠的质控方法。
关键词 高效液相色谱法;含量测定;清开灵;黄芩苷
中图分类号R284文献标识码A文章编号1673-9671-(2010)031-0066-02
清开灵是一种中药复方制剂, 由板蓝根、金银花、栀子、 黄芩苷、 胆酸等8种中药组成,具有清热解毒、镇静安神等作用。目前临床品种有清开灵口服液、清开灵注射液,清开灵颗粒、清开灵片、清开灵喷雾剂等
按现行标准《中国药典》2 005 版一部规定,其主要成分黄芩苷的含量测定为高效液相色谱法, 原标准《卫生部药品标准中药成方制剂( 第一分册)》是采用紫外分光光度法测定,本文就清开灵注射液、清开灵颗粒两种剂型中黄芩苷的含量,采用高效液相色谱法进行测定,以求探讨不同剂型清开灵中黄芩苷含量测定方法的改进。
1仪器与试药
1.1仪器
Waters公司高效液相色谱仪(带有Waters1525液相泵, Waters2996二极管阵列检测器. 自动进样装置),超声波清洗器(KQ—250A,昆山市超声波仪器厂),电子天平(FA2004.上海天平仪器厂),分析天平(TG328B上海天平仪器厂)。
1.2试药
黄芩对照品(中国药品生物制品检定所生产,批号0715-9909);清开灵注射液(广东永康药业有限公司生产, 10ml每支,每盒5支,批号分别为090612 、090805、090813、091027、091105) ,清开灵颗粒(市售),盐酸、 乙醇、甲醇(分析纯)、二次蒸馏水(自制)。
2实验
2.1 实验方法
色谱和检测条件 色谱柱:Kromasil C18分析柱(4.6mm×150mm,5um);流动相为甲醇-水-磷酸(60:40:0.2);检测波长280nm;流速1.0ml/min;柱温 30℃;进样体积 10ul。
2.2线性关系的考察
将黄芩苷对照品在 60℃条件下干燥4h至恒重。精密称取干燥的黄芩苷对照品25mg置于50ml容量瓶中. 加入50%甲醇30ml使其溶解。将标样超声处理10min. 放置室温后. 用50%甲醇稀释至刻度. 摇匀。即得0.5mg/ml(500ug/ml)的黄芩苷对照品溶液.准确吸取黄芩苷对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml . 分别置于10ml容量瓶中. 各加50%甲醇稀释至刻度. 摇匀。所得对照品溶液浓度为25、50、100、150、200ug/ml。按上述色谱条件,用0.45um滤膜过滤标样溶液,进样,平行测定3次,色谱图见图 1。
图1黄芩苷对照品HPLC色谱图
以峰面积为纵坐标,对照品浓度,(ug/ml)为横坐标, 绘制标准曲线, 由标准曲线可求得回归方程C=2.9869×10-5A+4.08875,r=0.9995(n=5)。结果表明黄芩苷在 25-200ug/ml范围内呈良好的线性关系。
2.3精密度实验
取五个浓度的黄芩苷对照品溶液. 每个浓度的溶液分别连续进样5次。按上述波谱条件进行测定. 测得峰面积。求得RSD分别为1.9%,1.0%,0.7%,0.9%,1.3%。
2.4回收率实验
取已准确称量得知黄芩苷含量的清开灵颗粒I 1.0030g,按样品处理方法将其配制成清开灵颗粒I样品溶液。准确量取5份1ml的上述溶液,分别置于 10ml 容量瓶中。再准确量取黄芩苷对照品溶液 1.0,1.5.2.0,2.5,3.0ml 分别置于装有清开灵颗粒I样品溶液的容量瓶中。 用50%甲醇稀释至 10ml。按样品测定方法,用上述色谱条件测定含量. 计算回收率分别为:101.64%,107.66%,110.88%,104.62%,107.855% 。
2.5样品中黄芩苷含量测定
清开灵注射液溶液的制备:准确量取清开灵注射液1ml ,置于50ml 容量瓶中,用50%甲醇稀释至刻度。摇匀即得到清开灵注射液溶液;清开灵颗粒溶液的制备:精确称量清开灵颗粒I1.0030g,清开灵颗粒Ⅱ1.0089g,分别置于50ml容量瓶中,用50%的甲醇30ml溶解,置于超声波清洗器中,超声10min。待完全溶解后用 50%甲醇稀释至刻度,将所配置的清开灵溶液用0.45ul滤膜过滤后,分别取10ul依次进样。按上述色谱条件进行测定,所得HPLC图,如图2。
图2清开灵注射液
图3清开灵颗粒I
图4清开灵颗粒II
3高效液相色谱法
3.1色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱Diamonsil C18(4 .6mm x 250mm,5um) ;以甲醇-水-磷酸(47: 53: 0.2)为流动相;流速为1.0ml/min;检测波长为276 nm;柱温为室温;进样量为20 ul。理论塔板数按黄芩苷峰计算不低于3000,以外标法计算含量。
3.2线性关系
精密称取干燥至恒重的黄芩苷对照品适量,置100ml量瓶中,加70 %乙醇适量使溶解, 加流动相1ml,再加70%乙醇稀释至刻度,摇匀, 作为对照品贮备液( 每lml中含黄芩苷503ug ) 。精密量取对照品贮备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4m l分别置10m l量瓶中,用70%乙醇稀释至刻度,按上述色谱条件分别进样,测定峰面积, 以峰面积为纵坐标, 对照液浓度为横坐标, 绘制标准曲线, 得回归方程为Y=3675X-91.42,r=0 .9995(n =7) 。结果表明黄芩苷在10-70ug/ml 范围内线性关系良好。
3.3稳定性试验
精密吸取清开灵注射液20ul(批号为090810)6份,按样品测定方法制备后,在8h内每小时测定1次,清开灵颗粒同法制备,RSD 分别为 0.79%,0.45%(n=8),表明两种剂型的供试品溶液在8h 内基本稳定。
3.4精密度试验
取浓度为5 0ug/m l的黄芩苷对照品溶液,连续进样6 次,每次进样20ul, 记录峰面积,结果RSD=0.53% (n= 6),說明该法精密度良好。
3.5重现性试验
取清开灵系列样品(清开灵注射液批号为090916 ),按样品测定方法分别平行测定6次,结果黄芩苷平均含量分别为4.80 mg/ml,RSD=0.78%;5.06mg/ml,RSD=0.61%,表明该法重现性良好。
3.6回收率试验
精密量取已知含量的清开灵及清开灵注射液各6 份, 分别加人一定量的黄芩苷对照品贮备液,按照含量测定方法进行测定, 计算回收率, 结果见表5,表6。
表5加样回收率试验(n=6)
表6加样回收率试验(n=6)
3.7样品测定
取清开灵注射液1ml,置100ml量瓶中,用70 %乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,弃去初滤液,取续滤液,作为供试品溶液;另取浓度50ug/ml黄芩苷对照品溶液,各精密吸取20ul,分别注入高效液相色谱仪,测定峰面积,按外标法计算含量,取装量差异项下的清开灵颗粒粗粉,研细,精密称取细粉适量,置100ml量瓶中,用70 %乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,弃去初滤液,取续滤液,作为供试品溶液,另取浓度50ug/ml黄芩苷对照品溶液, 各精密吸取20ul,分别注入高效液相色谱仪,测定峰面积,按外标法计算含量结果见表7。
表7含量测定结果
结果显示用HPLC法测定的黄芩苷的含量和产品中标识的黄芩苷的含量相差不大。
4 讨论
清开灵注射液最早收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第十六册(WS3一B一3098—98),标准中黄芩苷的含量测定为先经处理后采用分光光度法。在[中华人民共和国药典]中, 介绍了清开灵的口服液剂型,对其中黄芩苷的含量测定采用了高效液相色谱法。
[海峡药学]2001,13(1):33报道唐小明应用紫外分光光度法测定清开灵注射液中黄芩苷的含量。用浓HCL沉淀的方法提取黄芩苷,沉淀用70%的乙醇溶解定溶作为供试品溶液。以黃芩苷为对照品,在276nm波长处测定吸光度,以吸光度A为纵坐标,以浓度C为黄芩苷坐标,绘制标准曲线,得回归方程为C=16.0231A+0.00l7,r=0.9993。加样回收率为99.10%,RSD=0.49%(n=5);重复性RSD=0.382%;说明UV法有杂质干扰,RP-HPLC法准确性高。
本文采用高效液相色谱法在对不同批号的清开灵注射液及清开灵颗粒中黄芩苷的含量测定, 测定成分为黄芩苷单一成分, 简单,重现性好,结果可靠,通过实验验证实了高效液相色谱法的优点,简单、快捷、准确。实验结果表明,所测含量与药品说明书上所示含量相差不大,因此该测定方法可作为清开灵颗粒和清开灵注射液质控的有效方法之一。
参考文献
[1]国家药典委员会,WS3-163(X-153)-99(Z)国家药品标准新药转正标准第十六至二十六册[S].北京:人民卫生出版社,2006.
[2]韩梅海,成爱华,王江梅.RP-HPLC法测定保胎丸中黄芩苷的含量[J].中成药,2003,25(2):168-170.
[3]唐小明.紫外分光光度法测定清开灵注射液中黄芩苷的含量[J].海峡药学,2001,13(1):33.
关键词 高效液相色谱法;含量测定;清开灵;黄芩苷
中图分类号R284文献标识码A文章编号1673-9671-(2010)031-0066-02
清开灵是一种中药复方制剂, 由板蓝根、金银花、栀子、 黄芩苷、 胆酸等8种中药组成,具有清热解毒、镇静安神等作用。目前临床品种有清开灵口服液、清开灵注射液,清开灵颗粒、清开灵片、清开灵喷雾剂等
按现行标准《中国药典》2 005 版一部规定,其主要成分黄芩苷的含量测定为高效液相色谱法, 原标准《卫生部药品标准中药成方制剂( 第一分册)》是采用紫外分光光度法测定,本文就清开灵注射液、清开灵颗粒两种剂型中黄芩苷的含量,采用高效液相色谱法进行测定,以求探讨不同剂型清开灵中黄芩苷含量测定方法的改进。
1仪器与试药
1.1仪器
Waters公司高效液相色谱仪(带有Waters1525液相泵, Waters2996二极管阵列检测器. 自动进样装置),超声波清洗器(KQ—250A,昆山市超声波仪器厂),电子天平(FA2004.上海天平仪器厂),分析天平(TG328B上海天平仪器厂)。
1.2试药
黄芩对照品(中国药品生物制品检定所生产,批号0715-9909);清开灵注射液(广东永康药业有限公司生产, 10ml每支,每盒5支,批号分别为090612 、090805、090813、091027、091105) ,清开灵颗粒(市售),盐酸、 乙醇、甲醇(分析纯)、二次蒸馏水(自制)。
2实验
2.1 实验方法
色谱和检测条件 色谱柱:Kromasil C18分析柱(4.6mm×150mm,5um);流动相为甲醇-水-磷酸(60:40:0.2);检测波长280nm;流速1.0ml/min;柱温 30℃;进样体积 10ul。
2.2线性关系的考察
将黄芩苷对照品在 60℃条件下干燥4h至恒重。精密称取干燥的黄芩苷对照品25mg置于50ml容量瓶中. 加入50%甲醇30ml使其溶解。将标样超声处理10min. 放置室温后. 用50%甲醇稀释至刻度. 摇匀。即得0.5mg/ml(500ug/ml)的黄芩苷对照品溶液.准确吸取黄芩苷对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml . 分别置于10ml容量瓶中. 各加50%甲醇稀释至刻度. 摇匀。所得对照品溶液浓度为25、50、100、150、200ug/ml。按上述色谱条件,用0.45um滤膜过滤标样溶液,进样,平行测定3次,色谱图见图 1。
图1黄芩苷对照品HPLC色谱图
以峰面积为纵坐标,对照品浓度,(ug/ml)为横坐标, 绘制标准曲线, 由标准曲线可求得回归方程C=2.9869×10-5A+4.08875,r=0.9995(n=5)。结果表明黄芩苷在 25-200ug/ml范围内呈良好的线性关系。
2.3精密度实验
取五个浓度的黄芩苷对照品溶液. 每个浓度的溶液分别连续进样5次。按上述波谱条件进行测定. 测得峰面积。求得RSD分别为1.9%,1.0%,0.7%,0.9%,1.3%。
2.4回收率实验
取已准确称量得知黄芩苷含量的清开灵颗粒I 1.0030g,按样品处理方法将其配制成清开灵颗粒I样品溶液。准确量取5份1ml的上述溶液,分别置于 10ml 容量瓶中。再准确量取黄芩苷对照品溶液 1.0,1.5.2.0,2.5,3.0ml 分别置于装有清开灵颗粒I样品溶液的容量瓶中。 用50%甲醇稀释至 10ml。按样品测定方法,用上述色谱条件测定含量. 计算回收率分别为:101.64%,107.66%,110.88%,104.62%,107.855% 。
2.5样品中黄芩苷含量测定
清开灵注射液溶液的制备:准确量取清开灵注射液1ml ,置于50ml 容量瓶中,用50%甲醇稀释至刻度。摇匀即得到清开灵注射液溶液;清开灵颗粒溶液的制备:精确称量清开灵颗粒I1.0030g,清开灵颗粒Ⅱ1.0089g,分别置于50ml容量瓶中,用50%的甲醇30ml溶解,置于超声波清洗器中,超声10min。待完全溶解后用 50%甲醇稀释至刻度,将所配置的清开灵溶液用0.45ul滤膜过滤后,分别取10ul依次进样。按上述色谱条件进行测定,所得HPLC图,如图2。
图2清开灵注射液
图3清开灵颗粒I
图4清开灵颗粒II
3高效液相色谱法
3.1色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱Diamonsil C18(4 .6mm x 250mm,5um) ;以甲醇-水-磷酸(47: 53: 0.2)为流动相;流速为1.0ml/min;检测波长为276 nm;柱温为室温;进样量为20 ul。理论塔板数按黄芩苷峰计算不低于3000,以外标法计算含量。
3.2线性关系
精密称取干燥至恒重的黄芩苷对照品适量,置100ml量瓶中,加70 %乙醇适量使溶解, 加流动相1ml,再加70%乙醇稀释至刻度,摇匀, 作为对照品贮备液( 每lml中含黄芩苷503ug ) 。精密量取对照品贮备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4m l分别置10m l量瓶中,用70%乙醇稀释至刻度,按上述色谱条件分别进样,测定峰面积, 以峰面积为纵坐标, 对照液浓度为横坐标, 绘制标准曲线, 得回归方程为Y=3675X-91.42,r=0 .9995(n =7) 。结果表明黄芩苷在10-70ug/ml 范围内线性关系良好。
3.3稳定性试验
精密吸取清开灵注射液20ul(批号为090810)6份,按样品测定方法制备后,在8h内每小时测定1次,清开灵颗粒同法制备,RSD 分别为 0.79%,0.45%(n=8),表明两种剂型的供试品溶液在8h 内基本稳定。
3.4精密度试验
取浓度为5 0ug/m l的黄芩苷对照品溶液,连续进样6 次,每次进样20ul, 记录峰面积,结果RSD=0.53% (n= 6),說明该法精密度良好。
3.5重现性试验
取清开灵系列样品(清开灵注射液批号为090916 ),按样品测定方法分别平行测定6次,结果黄芩苷平均含量分别为4.80 mg/ml,RSD=0.78%;5.06mg/ml,RSD=0.61%,表明该法重现性良好。
3.6回收率试验
精密量取已知含量的清开灵及清开灵注射液各6 份, 分别加人一定量的黄芩苷对照品贮备液,按照含量测定方法进行测定, 计算回收率, 结果见表5,表6。
表5加样回收率试验(n=6)
表6加样回收率试验(n=6)
3.7样品测定
取清开灵注射液1ml,置100ml量瓶中,用70 %乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,弃去初滤液,取续滤液,作为供试品溶液;另取浓度50ug/ml黄芩苷对照品溶液,各精密吸取20ul,分别注入高效液相色谱仪,测定峰面积,按外标法计算含量,取装量差异项下的清开灵颗粒粗粉,研细,精密称取细粉适量,置100ml量瓶中,用70 %乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,弃去初滤液,取续滤液,作为供试品溶液,另取浓度50ug/ml黄芩苷对照品溶液, 各精密吸取20ul,分别注入高效液相色谱仪,测定峰面积,按外标法计算含量结果见表7。
表7含量测定结果
结果显示用HPLC法测定的黄芩苷的含量和产品中标识的黄芩苷的含量相差不大。
4 讨论
清开灵注射液最早收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第十六册(WS3一B一3098—98),标准中黄芩苷的含量测定为先经处理后采用分光光度法。在[中华人民共和国药典]中, 介绍了清开灵的口服液剂型,对其中黄芩苷的含量测定采用了高效液相色谱法。
[海峡药学]2001,13(1):33报道唐小明应用紫外分光光度法测定清开灵注射液中黄芩苷的含量。用浓HCL沉淀的方法提取黄芩苷,沉淀用70%的乙醇溶解定溶作为供试品溶液。以黃芩苷为对照品,在276nm波长处测定吸光度,以吸光度A为纵坐标,以浓度C为黄芩苷坐标,绘制标准曲线,得回归方程为C=16.0231A+0.00l7,r=0.9993。加样回收率为99.10%,RSD=0.49%(n=5);重复性RSD=0.382%;说明UV法有杂质干扰,RP-HPLC法准确性高。
本文采用高效液相色谱法在对不同批号的清开灵注射液及清开灵颗粒中黄芩苷的含量测定, 测定成分为黄芩苷单一成分, 简单,重现性好,结果可靠,通过实验验证实了高效液相色谱法的优点,简单、快捷、准确。实验结果表明,所测含量与药品说明书上所示含量相差不大,因此该测定方法可作为清开灵颗粒和清开灵注射液质控的有效方法之一。
参考文献
[1]国家药典委员会,WS3-163(X-153)-99(Z)国家药品标准新药转正标准第十六至二十六册[S].北京:人民卫生出版社,2006.
[2]韩梅海,成爱华,王江梅.RP-HPLC法测定保胎丸中黄芩苷的含量[J].中成药,2003,25(2):168-170.
[3]唐小明.紫外分光光度法测定清开灵注射液中黄芩苷的含量[J].海峡药学,2001,13(1):33.