【摘 要】
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目的:重组构建原核表达载体以正确表达巢蛋白样结构域(nidogen domains,NIDO)蛋白,并进一步纯化与鉴定.方法:PCR法拼接NIDO基因,经T-A连接亚克隆至pMD19-T载体,测序鉴定.采用
【机 构】
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现在连云港第二人民医院普外科,江苏连云港,220006;南京医科大学第一附属医院普通外科,江苏南京,210029
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目的:重组构建原核表达载体以正确表达巢蛋白样结构域(nidogen domains,NIDO)蛋白,并进一步纯化与鉴定.方法:PCR法拼接NIDO基因,经T-A连接亚克隆至pMD19-T载体,测序鉴定.采用质粒抽提、纯化、酶切、连接、感受态细胞制备和转化等技术,构建并鉴定原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO.药物诱导方式诱导NIDO-GST融合蛋白的表达.对表达产物进行分离,用SDS-PAGE检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量.对包涵体进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化.采用SDS-PAGE和质谱分析,鉴定纯化的目的蛋白.结果:测序证实了NIDO基因的正确合成和pMD 19-T-NIDO克隆载体的构建.原核表达系统pGEX-4T-1-NIDO构建成功,在大肠杆菌BL21中被诱导,获得高表达量的N-末端带有GST标签序列的重组融合表达蛋白(30％).超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多.将包涵体变性、复性后用GST亲和层析纯化,纯化蛋白＞80％并经质谱鉴定证实.结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO,能正确表达NIDO-GST融合蛋白,GST亲和层析对于NIDO-GST融合蛋白有较好的纯化效果.
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