论文部分内容阅读
摘要[目的] 利用全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GCTOFMS）分析技术同时测定白酒中10种吡嗪类物质。 [方法]吡嗪类物质是白酒中的一类重要健康功能成分，应用全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪结合液液萃取样品前处理过程同时检测白酒中10种吡嗪类物质。[结果]试验表明，标准曲线线性相关系数R2均大于0.99，相对标准偏差RSD在3.1%～11.3% ，加标回收率在79%～96%，该方法满足白酒中吡嗪类痕量物质的定量要求。[结论] 该试验方法分析结果准确，可用于白酒中吡嗪类物质的定性与定量分析。
关键词全二维气相色谱-飞行时间质谱；液液萃取；吡嗪；定量
中图分类号S38文献标识码A文章编号0517-6611（2015）26-354-02
Abstract[Objective] Simultaneous testing 10 pyrazines in liquor by two comprehensive dimensional gas chromatographytime of flight mass. [Method] Pyrazines are one of the most important flavors in Chinese liquor. The 10 pyrazines in liquor were analyzed by comprehensive two dimensional gas chromatographytime of flight mass spectrometry （GC×GCTOFMS） combined with liquidliquid extraction. [Result] The results showed that the 10 pyrazines were determined in liquor samples and they had a good linear relationship （R2> 0.99）， RSD between 3.1%-11.3% and their recover between 79%-96%. This method can be used to detect pyrazine in liquor. [Conclusion] The analysis result is accurate， which can be used in qualitative and quantitative analysis of pyrazine in liquor.
Key words GC×GCTOFMS； Liquidliquid extraction； Pyrazine； Quantification
吡嗪类物质是白酒中的一类重要健康功能成分，其中四甲基吡嗪对扩张血管、轻度降压、改善组织微循环、提高组织血液灌注、抑制血小板粘附聚集和血栓形成、抑制平滑肌细胞、调节脂质代谢以及抗脂质过氧化均有一定的治疗作用[1]。另外，由于吡嗪类物质大都具有焙烤香气及坚果香气，再加上该类物质的阈值较低。因此，该类物质对酒体的风味也起到了较大贡献作用[2-5]。
目前，分离白酒中吡嗪类物质的方法有液液萃取、固相萃取、固相微萃取、大孔径阴阳离子交换、二氧化碳超临界萃取[6-8]等。王柏文等利用二氯甲烷为提取剂，结合超声振荡萃取新型咂酒中的吡嗪类物质，最后应用GCMS对咂酒中的吡嗪进行定性、定量[9]。Worben H J等利用减压蒸馏的方式先将酒中的大部分易挥发性物质除掉，然后以二氯甲烷为萃取剂萃取朗姆酒中的吡嗪类物质，提取液经浓缩除水后供GCMS鉴定分析。Liebich H M等先使用乙醚/正戊烷的混合溶液对酒中的吡嗪类物质进行萃取分離，经GCMS检测分析，定性出朗姆酒中含有7种吡嗪类物质。唐坤甜采用顶空固相微萃取技术萃取啤酒麦芽中的含氮类香味物质，最后经GCMS进行定量分析[10]。
全二维气相色谱具分辨率高、灵敏度高、峰容量大等优势，十分适合于复杂体系的分析研究；飞行时间质谱具有很高的采集频率，能够实现与全二维气相色谱的最佳配合。再加上仪器自带的高性能数据处理软件，具备自动峰识别以及图谱去卷积解析功能，大大提高了检测分析的灵敏度[11-12]。笔者采用GC×GCTOFMS结合液液萃取样品前处理方式同时测定白酒中10种吡嗪类物质，此方法分析结果准确，可用于白酒中吡嗪类物质的定性与定量分析。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂。2乙酰基吡啶（内标）、吡嗪、2甲基吡嗪、2，3二甲基吡嗪、2，5二甲基吡嗪、2，6二甲基吡嗪、2乙基吡嗪、2乙基5甲基吡嗪、2，3，5三甲基吡嗪、2，3二乙基5甲基吡嗪、四甲基吡嗪，试剂均为进口高纯试剂；无水乙醇（色谱纯），无水乙醚（分析纯）。
1.1.2主要仪器。全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪（GC×GCTOFMS），美国力可公司；多功能样品前处理平台，德国Gerstel。
1.2方法
1.2.1内标及标准溶液配制。内标为2乙酰基吡啶，吸取一定量的内标物，用无水乙醇配制于50 ml容量瓶中，定容后作为内标贮备液，用无水乙醇稀释内标储备液浓度至500 mg/L；各称取一定量的吡嗪类标准物质，用无水乙醇溶解，转移到50 ml容量瓶中，定容后得到1 000 mg/L的吡嗪类标准物质储备液，置于4 ℃冰箱中避光保存。用无水乙醇将各个标准品储备液稀释配置成混合标准溶液，逐级稀释得到试验需要的不同梯度（20、10、5、2、1 mg/L）混合标准液。
1.2.2 吡嗪类标准品标准曲线绘制。 准确移取1 ml配制好的各级梯度混合标准溶液于2 ml液体进样瓶中，加入10 μl内标溶液，确保内标液浓度在标准品浓度梯度范围内。将上述5个梯度的吡嗪混合标准溶液在选定的色谱条件下进样分析，以标品浓度为横坐标，标品与内标的峰面积比值为纵坐标，绘制10种吡嗪类物质的标准曲线。 1.2.3白酒樣品液液萃取方法。取20 ml酒样，用2 mol/L的H2SO4溶液调整酒样酸度至[H+]=1 mol/L，将调好酸度的酒样转移至125 ml分液漏斗中，用30 ml重蒸乙醚萃取酒样，静置1 min，收集下层水相，用4 mol/L的NaOH溶液调节水相至pH 13，静置冷却5 min，用50 ml重蒸乙醚萃取水相溶液，静置1 min，收集上层有机相，加入适量无水Na2SO4干燥过夜后，N2吹浓缩至 1 ml，加入2乙酰基吡啶内标后，GC×GCTOFMS直接进样分析。
1.2.4GC×GCTOFMS分析条件。进样口温度230 ℃；载气为He；流速为1.0 ml/min；不分流；进样量1 μl；程序升温设置：一维柱温箱初始温度40 ℃，保持2 min，然后以4 ℃/min的升温速率升温至180 ℃，再以6 ℃/min的升温速率升温至230 ℃，保持15 min，二维柱温箱初始温度45 ℃，保持2 min，然后以4 ℃/min的升温速率升温至180 ℃，再以6 ℃/min的升温速率升温至230 ℃，保持15 min；柱系统：采用60 m×0.25 mm×0.25 μm DBwax为一维柱，2 m×0.18 mm×0.18 μm Rtx200为二维柱，两根色谱柱通过毛细管柱连接器以串联方式连接；调制器设置：设置为不工作；质谱条件：质谱检测器为飞行时间质谱，EI离子源温度200 ℃，电离电压：-70 V，传输线温度250 ℃，采用全扫描方式，质量采集范围30～400 amu，采集频率10张全谱图/s，检测器电压1 470 V。
1.2.5数据处理。所得数据再经Pegasus 4D的工作站自动处理，定性所用的图谱库为NIST/EPA/NIH Version 2.0，所得数据再经进一步处理得到最终结果。
2结果与分析
2.1标准样品保留时间及定量离子确定对标准样品的保留时间以及定量离子确定进行研究，结果分别见表1和图1。从图1可以看出，包括四甲基吡嗪在内的10种吡嗪类物质以及2乙酰基吡啶内标物的分离度良好，说明在该色谱分析条件下，能够确保各标准品之间相互不干扰。表1中给出了11种物质的保留时间、特征离子以及定量离子信息，其中特征离子为Pegasus 4D软件通过峰解卷积功能得出的，各种物质的特征离子间不存在干扰，从特征离子中选出丰度较高的特征离子作为定量离子。
2.3方法的RSD、加标回收率以及定量限按照信噪比10倍标准，计算10种吡嗪类物质的定量限，选取某一浓度梯度混合标准溶液进行5次平行试验，进行紧密度分析；将某一浓度梯度的混合标准溶液添加到样品酒中，经“1.2.3”所述的液液萃取前处理方法，测定方法的加标回收率，结果见表3。
从表3的结果可以看出，相对标准偏差RSD在3.1%～11.3%，说明该方法的精密度较好。加标回收率数据在79%～96%，虽然满足标准要求，但是也应看到该方法测量10种吡嗪类物质的加标回收率均小于100%，分析其原因，主要是因为样品在液液萃取前处理过程中，当[H+]=1 mol/L时，大约有90%的吡嗪类物质会转化成盐而溶解到水相中，因此会造成10%左右目标成分的损失[13]。
3结论
该研究利用全二维气相色谱-飞行时间质谱同时测定白酒中10种吡嗪类物质，全二维气相色谱具分辨率高、灵敏度高、峰容量大等优势，再加上仪器自带的高性能数据处理软件，具备自动峰识别以及图谱去卷积解析功能，大大提高了检测分析的灵敏度。另外，采用的液液萃取样品前处理方式，巧妙地引入除酯纯化步骤，降低了白酒中酸性及酯类成分对吡嗪类物质定量的干扰。对样品的测定结果表明，10种吡嗪类物质线性关系良好，相关系数R2在0.991～0.999，相对标准偏差RSD在3.1%～11.3%，加标回收率在79%～96%，满足白酒中吡嗪类痕量物质定量要求。
参考文献
[1] DALLGE J，BEENS J，BRINKMAN U A TH.Comprehensive twodimensional gas chromatography：a powerful and versatileanalytical tool[J].Chromatogr A，2003，1000（1/2）：69-108.
[2] 晁建平.重要的食品杂环香料：吡嗪类化合物[J].精细石油化工，1994（4）：44-47.
[3] RUDOLF M，SUGIMA R.Pyrazines：Occurrence， formation and biodegradation [J].Applied microbiology and biotechnollgy，2010，85：1315-1320.
[4] LENKA L，KATERINA R，JANA H，et al.Alternative GCMS approaches in the analysis of substituted pyrazines and other volatile aromatic compounds formed during Maillard reaction in potato chips [J].Analytical chimica acta，2009，641：101-109.
[5] HASSAN S，JACINTHE F，NATHALIE M.Identification of pyrazine derivatives in a typical maple syrup using headspace solidphase microextraction with gas chromatographymass spectrometry [J].Food chemistry，2012，133：1006-1010. [6] LLUS B，ROSALIA T，ANNA G，et al.Mass spectrometry identification of alkylsubstituted pyrazines produced by Pseudomonas spp.isolates obtained from wine corks [J].Food chemistry，2013，138：2382-2389.
[7] LAURA C，ANA E，EVA C，et al.Multidimensional gas chromatographymass spectrometry determination of 3alkyl2methoxypyrazines in wine and must a comparison of solidphase extraction and headspace solidphase extraction methods[J].Journal of chromatography A，2009，1216：4040-4045.
[8] PHILIPPUS A，MARIA A S，SYLVIA O P，et al.Survey of 3Alkyl2methoxypyrazine content of south African sauvignon blanc wines using a novel LCAPCIMS/MS method [J].Journal of agricultural and food chemistry，2009，57：9347-9355.
[9] 王柏文，李賀贺.应用液-液萃取结合GCMS与GCNPD技术对国井芝麻香型白酒中含氮化合物的分析[J].食品科学，2014，35（10）：126-131.
[10] 唐坤甜.顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法测定麦芽美拉德反应香味物质[J].啤酒科技，2013（12）：18-24.
[11] 季克良.全二维气相色谱/飞行时间质谱用于白酒微量成分的分析[J].酿酒科技，2007（3）：100-102.
[12] 郭琨.全二维气相色谱-飞行时间质谱联用技术分析重馏分油中芳烃组成[J].色谱，2012，30（2）：128-134.
[13] 王莉，雷良波.白酒中含氮类化合物定性分析方法[J].食品与生物技术学报，2014，33（8）：891-895.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2015，43（26）：369-372
关键词全二维气相色谱-飞行时间质谱；液液萃取；吡嗪；定量
中图分类号S38文献标识码A文章编号0517-6611（2015）26-354-02
Abstract[Objective] Simultaneous testing 10 pyrazines in liquor by two comprehensive dimensional gas chromatographytime of flight mass. [Method] Pyrazines are one of the most important flavors in Chinese liquor. The 10 pyrazines in liquor were analyzed by comprehensive two dimensional gas chromatographytime of flight mass spectrometry （GC×GCTOFMS） combined with liquidliquid extraction. [Result] The results showed that the 10 pyrazines were determined in liquor samples and they had a good linear relationship （R2> 0.99）， RSD between 3.1%-11.3% and their recover between 79%-96%. This method can be used to detect pyrazine in liquor. [Conclusion] The analysis result is accurate， which can be used in qualitative and quantitative analysis of pyrazine in liquor.
Key words GC×GCTOFMS； Liquidliquid extraction； Pyrazine； Quantification
吡嗪类物质是白酒中的一类重要健康功能成分，其中四甲基吡嗪对扩张血管、轻度降压、改善组织微循环、提高组织血液灌注、抑制血小板粘附聚集和血栓形成、抑制平滑肌细胞、调节脂质代谢以及抗脂质过氧化均有一定的治疗作用[1]。另外，由于吡嗪类物质大都具有焙烤香气及坚果香气，再加上该类物质的阈值较低。因此，该类物质对酒体的风味也起到了较大贡献作用[2-5]。
目前，分离白酒中吡嗪类物质的方法有液液萃取、固相萃取、固相微萃取、大孔径阴阳离子交换、二氧化碳超临界萃取[6-8]等。王柏文等利用二氯甲烷为提取剂，结合超声振荡萃取新型咂酒中的吡嗪类物质，最后应用GCMS对咂酒中的吡嗪进行定性、定量[9]。Worben H J等利用减压蒸馏的方式先将酒中的大部分易挥发性物质除掉，然后以二氯甲烷为萃取剂萃取朗姆酒中的吡嗪类物质，提取液经浓缩除水后供GCMS鉴定分析。Liebich H M等先使用乙醚/正戊烷的混合溶液对酒中的吡嗪类物质进行萃取分離，经GCMS检测分析，定性出朗姆酒中含有7种吡嗪类物质。唐坤甜采用顶空固相微萃取技术萃取啤酒麦芽中的含氮类香味物质，最后经GCMS进行定量分析[10]。
全二维气相色谱具分辨率高、灵敏度高、峰容量大等优势，十分适合于复杂体系的分析研究；飞行时间质谱具有很高的采集频率，能够实现与全二维气相色谱的最佳配合。再加上仪器自带的高性能数据处理软件，具备自动峰识别以及图谱去卷积解析功能，大大提高了检测分析的灵敏度[11-12]。笔者采用GC×GCTOFMS结合液液萃取样品前处理方式同时测定白酒中10种吡嗪类物质，此方法分析结果准确，可用于白酒中吡嗪类物质的定性与定量分析。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂。2乙酰基吡啶（内标）、吡嗪、2甲基吡嗪、2，3二甲基吡嗪、2，5二甲基吡嗪、2，6二甲基吡嗪、2乙基吡嗪、2乙基5甲基吡嗪、2，3，5三甲基吡嗪、2，3二乙基5甲基吡嗪、四甲基吡嗪，试剂均为进口高纯试剂；无水乙醇（色谱纯），无水乙醚（分析纯）。
1.1.2主要仪器。全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪（GC×GCTOFMS），美国力可公司；多功能样品前处理平台，德国Gerstel。
1.2方法
1.2.1内标及标准溶液配制。内标为2乙酰基吡啶，吸取一定量的内标物，用无水乙醇配制于50 ml容量瓶中，定容后作为内标贮备液，用无水乙醇稀释内标储备液浓度至500 mg/L；各称取一定量的吡嗪类标准物质，用无水乙醇溶解，转移到50 ml容量瓶中，定容后得到1 000 mg/L的吡嗪类标准物质储备液，置于4 ℃冰箱中避光保存。用无水乙醇将各个标准品储备液稀释配置成混合标准溶液，逐级稀释得到试验需要的不同梯度（20、10、5、2、1 mg/L）混合标准液。
1.2.2 吡嗪类标准品标准曲线绘制。 准确移取1 ml配制好的各级梯度混合标准溶液于2 ml液体进样瓶中，加入10 μl内标溶液，确保内标液浓度在标准品浓度梯度范围内。将上述5个梯度的吡嗪混合标准溶液在选定的色谱条件下进样分析，以标品浓度为横坐标，标品与内标的峰面积比值为纵坐标，绘制10种吡嗪类物质的标准曲线。 1.2.3白酒樣品液液萃取方法。取20 ml酒样，用2 mol/L的H2SO4溶液调整酒样酸度至[H+]=1 mol/L，将调好酸度的酒样转移至125 ml分液漏斗中，用30 ml重蒸乙醚萃取酒样，静置1 min，收集下层水相，用4 mol/L的NaOH溶液调节水相至pH 13，静置冷却5 min，用50 ml重蒸乙醚萃取水相溶液，静置1 min，收集上层有机相，加入适量无水Na2SO4干燥过夜后，N2吹浓缩至 1 ml，加入2乙酰基吡啶内标后，GC×GCTOFMS直接进样分析。
1.2.4GC×GCTOFMS分析条件。进样口温度230 ℃；载气为He；流速为1.0 ml/min；不分流；进样量1 μl；程序升温设置：一维柱温箱初始温度40 ℃，保持2 min，然后以4 ℃/min的升温速率升温至180 ℃，再以6 ℃/min的升温速率升温至230 ℃，保持15 min，二维柱温箱初始温度45 ℃，保持2 min，然后以4 ℃/min的升温速率升温至180 ℃，再以6 ℃/min的升温速率升温至230 ℃，保持15 min；柱系统：采用60 m×0.25 mm×0.25 μm DBwax为一维柱，2 m×0.18 mm×0.18 μm Rtx200为二维柱，两根色谱柱通过毛细管柱连接器以串联方式连接；调制器设置：设置为不工作；质谱条件：质谱检测器为飞行时间质谱，EI离子源温度200 ℃，电离电压：-70 V，传输线温度250 ℃，采用全扫描方式，质量采集范围30～400 amu，采集频率10张全谱图/s，检测器电压1 470 V。
1.2.5数据处理。所得数据再经Pegasus 4D的工作站自动处理，定性所用的图谱库为NIST/EPA/NIH Version 2.0，所得数据再经进一步处理得到最终结果。
2结果与分析
2.1标准样品保留时间及定量离子确定对标准样品的保留时间以及定量离子确定进行研究，结果分别见表1和图1。从图1可以看出，包括四甲基吡嗪在内的10种吡嗪类物质以及2乙酰基吡啶内标物的分离度良好，说明在该色谱分析条件下，能够确保各标准品之间相互不干扰。表1中给出了11种物质的保留时间、特征离子以及定量离子信息，其中特征离子为Pegasus 4D软件通过峰解卷积功能得出的，各种物质的特征离子间不存在干扰，从特征离子中选出丰度较高的特征离子作为定量离子。
2.3方法的RSD、加标回收率以及定量限按照信噪比10倍标准，计算10种吡嗪类物质的定量限，选取某一浓度梯度混合标准溶液进行5次平行试验，进行紧密度分析；将某一浓度梯度的混合标准溶液添加到样品酒中，经“1.2.3”所述的液液萃取前处理方法，测定方法的加标回收率，结果见表3。
从表3的结果可以看出，相对标准偏差RSD在3.1%～11.3%，说明该方法的精密度较好。加标回收率数据在79%～96%，虽然满足标准要求，但是也应看到该方法测量10种吡嗪类物质的加标回收率均小于100%，分析其原因，主要是因为样品在液液萃取前处理过程中，当[H+]=1 mol/L时，大约有90%的吡嗪类物质会转化成盐而溶解到水相中，因此会造成10%左右目标成分的损失[13]。
3结论
该研究利用全二维气相色谱-飞行时间质谱同时测定白酒中10种吡嗪类物质，全二维气相色谱具分辨率高、灵敏度高、峰容量大等优势，再加上仪器自带的高性能数据处理软件，具备自动峰识别以及图谱去卷积解析功能，大大提高了检测分析的灵敏度。另外，采用的液液萃取样品前处理方式，巧妙地引入除酯纯化步骤，降低了白酒中酸性及酯类成分对吡嗪类物质定量的干扰。对样品的测定结果表明，10种吡嗪类物质线性关系良好，相关系数R2在0.991～0.999，相对标准偏差RSD在3.1%～11.3%，加标回收率在79%～96%，满足白酒中吡嗪类痕量物质定量要求。
参考文献
[1] DALLGE J，BEENS J，BRINKMAN U A TH.Comprehensive twodimensional gas chromatography：a powerful and versatileanalytical tool[J].Chromatogr A，2003，1000（1/2）：69-108.
[2] 晁建平.重要的食品杂环香料：吡嗪类化合物[J].精细石油化工，1994（4）：44-47.
[3] RUDOLF M，SUGIMA R.Pyrazines：Occurrence， formation and biodegradation [J].Applied microbiology and biotechnollgy，2010，85：1315-1320.
[4] LENKA L，KATERINA R，JANA H，et al.Alternative GCMS approaches in the analysis of substituted pyrazines and other volatile aromatic compounds formed during Maillard reaction in potato chips [J].Analytical chimica acta，2009，641：101-109.
[5] HASSAN S，JACINTHE F，NATHALIE M.Identification of pyrazine derivatives in a typical maple syrup using headspace solidphase microextraction with gas chromatographymass spectrometry [J].Food chemistry，2012，133：1006-1010. [6] LLUS B，ROSALIA T，ANNA G，et al.Mass spectrometry identification of alkylsubstituted pyrazines produced by Pseudomonas spp.isolates obtained from wine corks [J].Food chemistry，2013，138：2382-2389.
[7] LAURA C，ANA E，EVA C，et al.Multidimensional gas chromatographymass spectrometry determination of 3alkyl2methoxypyrazines in wine and must a comparison of solidphase extraction and headspace solidphase extraction methods[J].Journal of chromatography A，2009，1216：4040-4045.
[8] PHILIPPUS A，MARIA A S，SYLVIA O P，et al.Survey of 3Alkyl2methoxypyrazine content of south African sauvignon blanc wines using a novel LCAPCIMS/MS method [J].Journal of agricultural and food chemistry，2009，57：9347-9355.
[9] 王柏文，李賀贺.应用液-液萃取结合GCMS与GCNPD技术对国井芝麻香型白酒中含氮化合物的分析[J].食品科学，2014，35（10）：126-131.
[10] 唐坤甜.顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法测定麦芽美拉德反应香味物质[J].啤酒科技，2013（12）：18-24.
[11] 季克良.全二维气相色谱/飞行时间质谱用于白酒微量成分的分析[J].酿酒科技，2007（3）：100-102.
[12] 郭琨.全二维气相色谱-飞行时间质谱联用技术分析重馏分油中芳烃组成[J].色谱，2012，30（2）：128-134.
[13] 王莉，雷良波.白酒中含氮类化合物定性分析方法[J].食品与生物技术学报，2014，33（8）：891-895.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2015，43（26）：369-372