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摘要：目的探讨木贼有效部位抑制氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC-ECV304）凋亡的可能机制。方法体外ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞损伤，用木贼有效部位进行干预；采用流式细胞术检测细胞凋亡率及Caspase-3蛋白；反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测内皮细胞Caspase-3mRNA表达。结果ox-LDL可明显诱导内皮细胞凋亡，上调Caspase-3mRNA及Caspase-3蛋白表达，木贼有效部位干预后细胞凋亡率明显下降（P<0.05），Caspase-3mRNA及Caspase-3蛋白表达明显下调（P<0.01）。结论木贼有效部位通过对凋亡相关基因的调控最终抑制Caspase-3蛋白的表达来减少内皮细胞的凋亡。
关键词：木贼；有效部位；氧化低密度脂蛋白；内皮细胞；凋亡；Caspase-3
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）06-0071-03
【Abstract】Objective： To study the possible mechanism of inhibiting human umbilical vein endothelial cells （HUVEC-ECV304） apoptosis induced by oxidized low density lipoprotein （ox-LDL）. Methods： Ox-LDL in vitro was used to induce human umbilical vein endothelial cell injury and effective part of Equisetum was used to intervene. Flow cytometry was used to detect cell apoptotic rate and Caspase-3 protein and reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to detect endothelial cell Caspase-3 mRNA expression. Results： Ox-LDL could induce the apoptosis of endothelial cells and up-regulate Caspase-3 mRNA and Caspase-3 protein expression. The apoptotic rate significantly decreased （P<0.05） after the intervention of the effective part of Equisetum and Caspase-3 mRNA and Caspase-3 protein expression obviously down-regulated （P<0.01）. Conclusion： The effective part of Equisetum can inhibit the apoptosis of endothelial cells by controlling the expression of Caspase-3 protein through regulating apoptosis-related genes.
【Key words】Equisetum， effective part， oxidized low density lipoprotein， endothelial cell， apoptosis， Caspase-3
木賊为多年生草本植物，药用部位为木贼的干燥地上部分，传统用于“疏风散热、解肌退翳”等作用，现代研究证实其有抗动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的作用[1]。本课题组证实木贼大孔树脂提取物中主要含黄酮及芬酸类化合物，这两种成分对氧化低密度脂蛋白损伤的内皮细胞有保护作用，且笔者初步阐明其保护内皮细胞是通过抗内皮细胞凋亡机制来实现的[2-3]。本实验通过研究木贼提取物对ox-LDL诱导的人主动脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）的凋亡及Caspase-3mRNA与Caspase-3蛋白水平表达的影响，进一步探讨木贼保护内皮细胞抗凋亡的具体途径，为木贼抗动脉粥样硬化的下一步开发利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器CO2恒温培养箱，美国Revco；756MC型紫外-可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；Gen Amp5700型PCR仪，美国PE公司；FR-200A凝胶扫描系统，上海复日科技有限公司；微量移液器，美国eppendorf；Epics-XLⅡ型流式细胞仪，美国B-C公司；木贼饮片，购于石家庄市乐仁堂大药房，经河北医科大学中医学院中药系鉴定；槲皮素和阿魏酸标准品，中国药品生物制品检定所，批号0080-9705，0773-9910；D101型大孔树脂，天津大均科技开发有限公司；人脐静脉内皮细胞株ECV304，武汉大学中国动植物保存中心；新生小牛血清，四季青公司；DMEM培养液及胰酶，GIBCO公司；总RNA提取试剂（TRIzol）、cDNA第一链合成试剂盒、PCR试剂盒及DNA Marker，均为北京TIANGEN公司；PCR引物，北京三博远志生物公司；Caspase-3鼠抗人多克隆抗体，美国Santa Cruz公司；羊抗兔IgG-PE二抗，美国Santa Cruz公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2木贼有效部位的制备称取适量木贼饮片置于圆底烧瓶中，加12倍量的70%的乙醇浸泡2h，电热套加热回流提取3次，每次2h，过滤并合并滤液，得木贼提取液。称取大孔树脂40 g，将提取液上树脂柱，先以水冲至洗脱液近无色后（Molish反应阴性）分别用蒸馏水，30%乙醇，70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液作为测试样品，分别以槲皮素和阿魏酸为对照品用紫外分光光度计检测此样品中总黄酮和总酚酸含量并测定其纯度。将70%乙醇洗脱液减压浓缩后，用无血清培养基DMEM将样品稀释，以二甲基亚砜（DMSO）使其充分溶解，此为用于本实验的木贼有效部位。 1.3ox-LDL的制备采用沉淀法参照文献[4]制备。
1.4细胞培养与分组采用15%新生小牛血清DMEM作为培养液，在37℃、5%CO2培养箱中瓶养人脐静脉内皮细胞。取对数生长期细胞15瓶，将细胞培养液换成无血清DMEM培养液，培养6h后随机分成3组①对照组：无血清DMEM培养液；②模型组：无血清DMEM培养液培养1h后加入ox-LDL，使其终浓度为80μg/ml；③木贼有效部位组（以下简称有效部位组）：无血清DMEM培养液中加入木贼有效部位，使其终浓度为50μg/ml，培养1h后加入ox-LDL，使其终浓度为80 μg/ml。继续培养12h后收集细胞和培养液进行检测。
1.5流式细胞仪检测细胞凋亡率及Caspase-3蛋白用胰酶消化收获细胞并用PBS冲洗2次，1500 r/in离心5min弃上清，细胞用70%冷乙醇固定，置于-20℃保存待测。碘化丙啶染色后，流式细胞仪检测内皮细胞凋亡率。加入Caspase-3多克隆一抗，IgG-PE二抗，进行免疫荧光数据分析。以荧光指数（FI）表示其蛋白表达的相对含量，公式：FI=（样品平均荧光强度-对照样品平均荧光强度）/正常对照样品平均荧光强度。（FI>1.0为阳性，FI≤1.0为阴性）
1.6RT-PCR 按Trizol试剂盒说明书提取各组细胞总mRNA，经2%琼脂糖凝胶电泳后，每一样品均出现清晰的28 s和18 s条带，且28 s条带的亮度和宽度约为18 s条带的2倍，纯度鉴定A260/A280值为1.8～2.0。RNA的反转录过程及扩增过程分别按试剂盒说明书进行。Caspase-3引物序列为：上游5′-ATACTCCTTCCATCAAATAG-3′，下游5′-AACATCACAAAACCATAATC-3′，扩增产物全长411bp；内参GAPDH引物序列为：上游5′-GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游5′-GGTGAAGACGCCAGTGGACTC-3′，扩增产物全长300bp。Caspase-3反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30s，47℃退火60s，72℃延伸60 s；GAPDH反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s；以上均30个循环后再72℃延伸5 min。取10 μL反应产物在2%琼脂糖凝胶（含EB）上电泳，FR-980生物电泳图像分析软件分析灰度值，以目的条带与内参照GAPDH条带的灰度比值代表目的基因mRNA的表达水平。
1.7统计学处理实验数据以表示，SPSS 15.0统计处理，样本间采用单因素方差分析，S-N-K q检验。
2结果
2.1流式细胞仪检测细胞凋亡率流式细胞仪分析结果显示：模型组细胞凋亡率较对照组显著升高，差异存在显著性（P<0.05）。加入木贼有效部位后细胞凋亡率较模型组明显下降（P<0.05）。见表1。
2.2Caspase-3 mRNA及Caspase-3蛋白表达与对照组比较模型组Caspase-3mRNA及Caspase-3蛋白的表达均明显升高（P<0.01）；与模型组相比有效部位组Caspase-3mRNA及Caspase-3蛋白的表达均显著降低（P<0.01）。见图1及表1。
3讨论
本课题组前期动物实验及体外细胞实验均证实木贼有保护血管内皮细胞，抑制AS形成的作用[2，5]，并进一步确定木贼有效药理成分为黄酮及芬酸类化合物，且对其抗内皮细胞凋亡途径进行了探讨[6]。
细胞凋亡机制的核心成分是蛋白酶，细胞凋亡的过程就是蛋白酶级联反应的过程，不同的蛋白酶在不同凋亡阶段发挥其功能。Caspase蛋白都是半胱氨酸家族蛋白酶，细胞凋亡的过程实际上是Caspase蛋白不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。Casepase蛋白是以没有活性的酶的前体而存在，大多数能被蛋白水解片段激活，具有使细胞解体成凋亡小体的作用。而Caspase-3蛋白是其中起非常关键作用的一员，在蛋白酶级联切割过程中，Caspase-3蛋白处于核心位置，在凋亡的执行阶段发挥着非常重要的作用，为凋亡过程级联反应中起共同作用的下游分子，是凋亡级联反应的最终执行者，被称为死亡蛋白酶。这是因为不同的蛋白酶分别切割Caspase-3蛋白酶原，从而激活Caspase-3蛋白，活化的Caspase-3蛋白进一步又切割不同的底物，导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞走向凋亡[7]。本实验中观察到，模型组细胞凋亡率升高的同时相应Caspase-3蛋白产生增多，表明ox-LDL可通过诱导Caspase-3蛋白的增多加速内皮细胞的凋亡而诱导内皮细胞损伤；木贼有效部位则可明显逆转这一趋势，使Caspase-3蛋白表达减少相应凋亡率下降。这表明木贼有效部位可通过抑制处于凋亡核心位置的Caspase-3蛋白表达，切断蛋白酶级联放大过程，最终从凋亡执行阶段抑制细胞凋亡。并且各组细胞Caspase-3mRNA的表达与其蛋白表达趋势一致，进一步说明木贼有效部位是通过抑制Caspase-3基因转录来实现Caspase-3蛋白减少的。
经典的细胞凋亡信号传导通路有两条，即线粒体途径与死亡受体途径。促凋亡蛋白（Bax和Bad）与抑凋亡蛋白（Bcl-2和Bcl-xl）同属Bcl-2家族成员蛋白，是线粒体凋亡途径的调节者[8]。而Caspase-3蛋白是这两条通路的共同路径。笔者之前曾报道[6]木贼有效部位抑制内皮细胞凋亡途径之一是通过下调LOX-1表达来抑制NOX4激活，进而通过调控Bcl-2mRNA及Caspase-3mRNA表达减少内皮细胞的凋亡。這提示木贼抗凋亡应该是通过线粒体途径来完成的，通过本实验可知这一途径最终是通过抑制Caspase-3蛋白酶表达来实现的，这进一步明确了木贼有效部位抑制内皮细胞凋亡的通路。
参考文献：
[1]朴惠顺，金光洙.木贼的化学成分和药理作用研究进展[J].时针国医国药，2006，17（6）：1077-1078.
[2]李志永，李国拉，王辉，等.木贼有效部位提取物对氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的干预[J].中国老年学杂志，2010，30（15）：2160-2162.
[3]李志永，王旭辉，李奕，等.木贼有效部位提取物对氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡相关基因的调控[J].中国老年学杂志，2012；32（19）：4186-4188.
[4]姜远英，曾华武.改良沉淀法快速分离制备人血清低密度脂蛋白[J].第二军医大学学报，1997；18（4）：389-391.
[5]甄艳军，安杰，侯建明，等.木贼对动脉粥样硬化早期大鼠内皮细胞凋亡及Bax、Bcl-2表达的影响[J].中国老年学杂志，2003；23（5）：304-305.
[6]李志永，李玲，李丽玮，等.木贼有效部位抑制氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡及LOX-1、NOX4mRNA的表达[J].中国老年学杂志，2016，36（10）：2343-2345.
[7]彭黎明，王曾礼.细胞凋亡的基础与临床[M].北京：人民卫生出版社，2000：87-90.
[8]Song X，Wang B，Lin S，et al.Astaxanthin inhibiits apoptosis in alveolar epithelial cells type Ⅱ in vivo and in vitro through the ROS-dependent mitochondrial signalling pathway[J].J Cell Mol Med，2014，18（11）：2198-2212.
关键词：木贼；有效部位；氧化低密度脂蛋白；内皮细胞；凋亡；Caspase-3
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）06-0071-03
【Abstract】Objective： To study the possible mechanism of inhibiting human umbilical vein endothelial cells （HUVEC-ECV304） apoptosis induced by oxidized low density lipoprotein （ox-LDL）. Methods： Ox-LDL in vitro was used to induce human umbilical vein endothelial cell injury and effective part of Equisetum was used to intervene. Flow cytometry was used to detect cell apoptotic rate and Caspase-3 protein and reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to detect endothelial cell Caspase-3 mRNA expression. Results： Ox-LDL could induce the apoptosis of endothelial cells and up-regulate Caspase-3 mRNA and Caspase-3 protein expression. The apoptotic rate significantly decreased （P<0.05） after the intervention of the effective part of Equisetum and Caspase-3 mRNA and Caspase-3 protein expression obviously down-regulated （P<0.01）. Conclusion： The effective part of Equisetum can inhibit the apoptosis of endothelial cells by controlling the expression of Caspase-3 protein through regulating apoptosis-related genes.
【Key words】Equisetum， effective part， oxidized low density lipoprotein， endothelial cell， apoptosis， Caspase-3
木賊为多年生草本植物，药用部位为木贼的干燥地上部分，传统用于“疏风散热、解肌退翳”等作用，现代研究证实其有抗动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的作用[1]。本课题组证实木贼大孔树脂提取物中主要含黄酮及芬酸类化合物，这两种成分对氧化低密度脂蛋白损伤的内皮细胞有保护作用，且笔者初步阐明其保护内皮细胞是通过抗内皮细胞凋亡机制来实现的[2-3]。本实验通过研究木贼提取物对ox-LDL诱导的人主动脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）的凋亡及Caspase-3mRNA与Caspase-3蛋白水平表达的影响，进一步探讨木贼保护内皮细胞抗凋亡的具体途径，为木贼抗动脉粥样硬化的下一步开发利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器CO2恒温培养箱，美国Revco；756MC型紫外-可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；Gen Amp5700型PCR仪，美国PE公司；FR-200A凝胶扫描系统，上海复日科技有限公司；微量移液器，美国eppendorf；Epics-XLⅡ型流式细胞仪，美国B-C公司；木贼饮片，购于石家庄市乐仁堂大药房，经河北医科大学中医学院中药系鉴定；槲皮素和阿魏酸标准品，中国药品生物制品检定所，批号0080-9705，0773-9910；D101型大孔树脂，天津大均科技开发有限公司；人脐静脉内皮细胞株ECV304，武汉大学中国动植物保存中心；新生小牛血清，四季青公司；DMEM培养液及胰酶，GIBCO公司；总RNA提取试剂（TRIzol）、cDNA第一链合成试剂盒、PCR试剂盒及DNA Marker，均为北京TIANGEN公司；PCR引物，北京三博远志生物公司；Caspase-3鼠抗人多克隆抗体，美国Santa Cruz公司；羊抗兔IgG-PE二抗，美国Santa Cruz公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2木贼有效部位的制备称取适量木贼饮片置于圆底烧瓶中，加12倍量的70%的乙醇浸泡2h，电热套加热回流提取3次，每次2h，过滤并合并滤液，得木贼提取液。称取大孔树脂40 g，将提取液上树脂柱，先以水冲至洗脱液近无色后（Molish反应阴性）分别用蒸馏水，30%乙醇，70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液作为测试样品，分别以槲皮素和阿魏酸为对照品用紫外分光光度计检测此样品中总黄酮和总酚酸含量并测定其纯度。将70%乙醇洗脱液减压浓缩后，用无血清培养基DMEM将样品稀释，以二甲基亚砜（DMSO）使其充分溶解，此为用于本实验的木贼有效部位。 1.3ox-LDL的制备采用沉淀法参照文献[4]制备。
1.4细胞培养与分组采用15%新生小牛血清DMEM作为培养液，在37℃、5%CO2培养箱中瓶养人脐静脉内皮细胞。取对数生长期细胞15瓶，将细胞培养液换成无血清DMEM培养液，培养6h后随机分成3组①对照组：无血清DMEM培养液；②模型组：无血清DMEM培养液培养1h后加入ox-LDL，使其终浓度为80μg/ml；③木贼有效部位组（以下简称有效部位组）：无血清DMEM培养液中加入木贼有效部位，使其终浓度为50μg/ml，培养1h后加入ox-LDL，使其终浓度为80 μg/ml。继续培养12h后收集细胞和培养液进行检测。
1.5流式细胞仪检测细胞凋亡率及Caspase-3蛋白用胰酶消化收获细胞并用PBS冲洗2次，1500 r/in离心5min弃上清，细胞用70%冷乙醇固定，置于-20℃保存待测。碘化丙啶染色后，流式细胞仪检测内皮细胞凋亡率。加入Caspase-3多克隆一抗，IgG-PE二抗，进行免疫荧光数据分析。以荧光指数（FI）表示其蛋白表达的相对含量，公式：FI=（样品平均荧光强度-对照样品平均荧光强度）/正常对照样品平均荧光强度。（FI>1.0为阳性，FI≤1.0为阴性）
1.6RT-PCR 按Trizol试剂盒说明书提取各组细胞总mRNA，经2%琼脂糖凝胶电泳后，每一样品均出现清晰的28 s和18 s条带，且28 s条带的亮度和宽度约为18 s条带的2倍，纯度鉴定A260/A280值为1.8～2.0。RNA的反转录过程及扩增过程分别按试剂盒说明书进行。Caspase-3引物序列为：上游5′-ATACTCCTTCCATCAAATAG-3′，下游5′-AACATCACAAAACCATAATC-3′，扩增产物全长411bp；内参GAPDH引物序列为：上游5′-GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游5′-GGTGAAGACGCCAGTGGACTC-3′，扩增产物全长300bp。Caspase-3反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30s，47℃退火60s，72℃延伸60 s；GAPDH反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s；以上均30个循环后再72℃延伸5 min。取10 μL反应产物在2%琼脂糖凝胶（含EB）上电泳，FR-980生物电泳图像分析软件分析灰度值，以目的条带与内参照GAPDH条带的灰度比值代表目的基因mRNA的表达水平。
1.7统计学处理实验数据以表示，SPSS 15.0统计处理，样本间采用单因素方差分析，S-N-K q检验。
2结果
2.1流式细胞仪检测细胞凋亡率流式细胞仪分析结果显示：模型组细胞凋亡率较对照组显著升高，差异存在显著性（P<0.05）。加入木贼有效部位后细胞凋亡率较模型组明显下降（P<0.05）。见表1。
2.2Caspase-3 mRNA及Caspase-3蛋白表达与对照组比较模型组Caspase-3mRNA及Caspase-3蛋白的表达均明显升高（P<0.01）；与模型组相比有效部位组Caspase-3mRNA及Caspase-3蛋白的表达均显著降低（P<0.01）。见图1及表1。
3讨论
本课题组前期动物实验及体外细胞实验均证实木贼有保护血管内皮细胞，抑制AS形成的作用[2，5]，并进一步确定木贼有效药理成分为黄酮及芬酸类化合物，且对其抗内皮细胞凋亡途径进行了探讨[6]。
细胞凋亡机制的核心成分是蛋白酶，细胞凋亡的过程就是蛋白酶级联反应的过程，不同的蛋白酶在不同凋亡阶段发挥其功能。Caspase蛋白都是半胱氨酸家族蛋白酶，细胞凋亡的过程实际上是Caspase蛋白不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。Casepase蛋白是以没有活性的酶的前体而存在，大多数能被蛋白水解片段激活，具有使细胞解体成凋亡小体的作用。而Caspase-3蛋白是其中起非常关键作用的一员，在蛋白酶级联切割过程中，Caspase-3蛋白处于核心位置，在凋亡的执行阶段发挥着非常重要的作用，为凋亡过程级联反应中起共同作用的下游分子，是凋亡级联反应的最终执行者，被称为死亡蛋白酶。这是因为不同的蛋白酶分别切割Caspase-3蛋白酶原，从而激活Caspase-3蛋白，活化的Caspase-3蛋白进一步又切割不同的底物，导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞走向凋亡[7]。本实验中观察到，模型组细胞凋亡率升高的同时相应Caspase-3蛋白产生增多，表明ox-LDL可通过诱导Caspase-3蛋白的增多加速内皮细胞的凋亡而诱导内皮细胞损伤；木贼有效部位则可明显逆转这一趋势，使Caspase-3蛋白表达减少相应凋亡率下降。这表明木贼有效部位可通过抑制处于凋亡核心位置的Caspase-3蛋白表达，切断蛋白酶级联放大过程，最终从凋亡执行阶段抑制细胞凋亡。并且各组细胞Caspase-3mRNA的表达与其蛋白表达趋势一致，进一步说明木贼有效部位是通过抑制Caspase-3基因转录来实现Caspase-3蛋白减少的。
经典的细胞凋亡信号传导通路有两条，即线粒体途径与死亡受体途径。促凋亡蛋白（Bax和Bad）与抑凋亡蛋白（Bcl-2和Bcl-xl）同属Bcl-2家族成员蛋白，是线粒体凋亡途径的调节者[8]。而Caspase-3蛋白是这两条通路的共同路径。笔者之前曾报道[6]木贼有效部位抑制内皮细胞凋亡途径之一是通过下调LOX-1表达来抑制NOX4激活，进而通过调控Bcl-2mRNA及Caspase-3mRNA表达减少内皮细胞的凋亡。這提示木贼抗凋亡应该是通过线粒体途径来完成的，通过本实验可知这一途径最终是通过抑制Caspase-3蛋白酶表达来实现的，这进一步明确了木贼有效部位抑制内皮细胞凋亡的通路。
参考文献：
[1]朴惠顺，金光洙.木贼的化学成分和药理作用研究进展[J].时针国医国药，2006，17（6）：1077-1078.
[2]李志永，李国拉，王辉，等.木贼有效部位提取物对氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的干预[J].中国老年学杂志，2010，30（15）：2160-2162.
[3]李志永，王旭辉，李奕，等.木贼有效部位提取物对氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡相关基因的调控[J].中国老年学杂志，2012；32（19）：4186-4188.
[4]姜远英，曾华武.改良沉淀法快速分离制备人血清低密度脂蛋白[J].第二军医大学学报，1997；18（4）：389-391.
[5]甄艳军，安杰，侯建明，等.木贼对动脉粥样硬化早期大鼠内皮细胞凋亡及Bax、Bcl-2表达的影响[J].中国老年学杂志，2003；23（5）：304-305.
[6]李志永，李玲，李丽玮，等.木贼有效部位抑制氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡及LOX-1、NOX4mRNA的表达[J].中国老年学杂志，2016，36（10）：2343-2345.
[7]彭黎明，王曾礼.细胞凋亡的基础与临床[M].北京：人民卫生出版社，2000：87-90.
[8]Song X，Wang B，Lin S，et al.Astaxanthin inhibiits apoptosis in alveolar epithelial cells type Ⅱ in vivo and in vitro through the ROS-dependent mitochondrial signalling pathway[J].J Cell Mol Med，2014，18（11）：2198-2212.