【摘 要】
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目的 建立靶向人Apo A-Ⅰ转录调控序列的高通量药物筛选模型,用于筛选Apo A-Ⅰ基因表达上调剂.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增Apo A-Ⅰ上游的启动子序列,克隆至荧光素酶报
【机 构】
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中国医学科学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室,北京,100050;国家新药(微生物)筛选实验室;
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目的 建立靶向人Apo A-Ⅰ转录调控序列的高通量药物筛选模型,用于筛选Apo A-Ⅰ基因表达上调剂.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增Apo A-Ⅰ上游的启动子序列,克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL4.17上游,采用脂质体介导的方法将重组质粒转染人肝癌细胞HepG2,在G418抗性存在的条件下,通过有限稀释法筛选稳定转染细胞株.对溶剂浓度和药物作用时间进行条件优化,应用阳性化合物染料木素评价模型有效性,通过检测荧光素酶的表达活性变化来筛选人Apo A-Ⅰ基因表达上调剂.结果 通过PCR成功扩增了人Apo A-Ⅰ基因上游的启动予序列,构建了相应的重组荧光素酶报告基因质粒pGL4-ApoP,并建立稳定转染细胞株ApoP-Luc HepG2.对筛选条件优化后,应用阳性化合物进行评价,筛选窗相关系数Z因子为0.68,大于0.5,适于进行高通量筛选.应用该筛选模型对5000余种化合物进行筛选,4个黄酮类化合物和白藜芦醇显示出较好的活性,半数有效浓度均小于10μg/ml.结论 成功建立了人Apo A-Ⅰ基因表达上调剂筛选模型,并利用该模型筛选到5个活性化合物.
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