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【摘要】目的：探讨海南野扇花对免疫功能，止血功能的影响。方法：将小鼠分为海南野扇花给药高（13g/kg）、中（65g/kg）、低（33g/kg）剂量组及阴性（生理盐水）、阳性（云南白药）对照组，采用半数溶血试验（HC50）；鸡红细胞吞噬实验；凝血试验考察药物的药效学作用。结果：海南野扇花高，中剂量均能显著提升（P<001，P<005）小鼠血清溶血素含量；显著增加（P<001）小鼠巨噬细胞吞噬功能；凝血试验的高、中剂量均显著缩短（P<001）小鼠凝血时间。结论：海南野扇花作为一种活血化瘀，消炎止血的药物，具有良好的生物学活性。
【关键词】黎药；海南野扇花；免疫功能；止血
【中图分类号】R29【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）05-0046-03
黎族在海南具有3000多年的生活史[1]，为了生存和繁衍，黎族人依托海南独特的热带资源气候，逐渐探索和实践出了丰富的具有民族特色医药知识[2]。海南野扇花（Sarcococca vagans Stapf）为黄杨科野扇花属植物，主要分布于我国海南、云南、广西等地区[3]。报道集中于海南野扇花的化学成分研究，未见药理药效方面研究。海南民间用以活血化瘀，消炎止痛，常用于跌打损伤后的止血及瘀血祛除，以及咽喉肿痛、风热感冒的消炎止痛。研究参考黎族民间常用用法，考虑其具有止血、提升巨噬细胞吞噬血块的能力，同时可能具有提高免疫力，增强抵抗力的作用。故设计免疫力功能试验及止血试验，为今后开发新药提供一定的研究数据。
1仪器与材料
11实验动物KM小鼠，体重18～22g，雌雄各半，由海南省实验动物中心提供，许可证号SCXK（琼）2015-0007；动物饲养于海南省药物研究所SPF动物房，使用许可证号：SYXK（瓊）2014-0025。
12药物海南野扇花由五指山海南黎族民间医药研究协会提供，经海南省药物研究所鉴定；云南白药（批号：ZBA1505，云南白药集团股份有限公司）。
13仪器二氧化碳培养箱、十万分之一天平、离心机、紫外分光光度计、显微镜、手术器械。
14试剂Hank′s液（20150604，Biohao Biotechnology CoLtd）；PBS缓冲液（批号：20150629，Biohao）；SRBC（批号：20150806，鸿泉生物）；SA缓冲液（批号：20150811，Biohao）；瑞姬氏染液（批号：上海源叶生物科技）；都氏试剂（批号：D5941-6VL，SIGMA）。
2方法
21分组与给药海南野扇花的推荐剂量为成人（体重70kg）每日50g生药量，依据体重换算系数[4]，20g标准小鼠等效剂量为170×00026=013g，即等效小鼠剂量65g/kg，设置为给药中剂量组，高低剂量组分别为等效剂量2倍和05倍，即高、中、低剂量组分别为每日13、65、33g/kg。
将海南野扇花干品粉碎，取130g药材粉加8倍量纯化水浸泡2h，大火煎煮30min，过滤收集滤液，剩余药材再加8倍量水重复煎煮，合并滤液，浓缩至100mL（含生药13g/mL）用于高剂量组。中剂量及低剂量给药组分别为高剂量给药组稀释2倍及4倍。小鼠按每10g体重给药01mL给药，每日一次。
阳性对照组：云南白药胶囊，用纯化水配置为00026g/mL溶液，小鼠按每10g体重给药01mL，1次/d。阴性对照组：等量纯化水，每日按10g体重给药01mL。
22血清溶血素测定试验[5]随机取KM小鼠40只，分为给药高、中、低剂量组及阴性对照组，每组10只，雌雄各半。每日按每10g体重给药01mL，连续给药30d，采用半数溶血值（HC50）的测定方法进行实验。结束前4d以2%（v/v）浓度的绵羊血红细胞（SRBC）免疫小鼠，4d后，小鼠采血分离血清，用SA缓冲溶液稀释200倍，取稀释后血清1mL放入试管内，加入10% SRBC 05mL和1∶8稀释的豚鼠血清补体1mL。另设置不加血清的对照管。置于37℃恒温水浴箱内水浴30min，立即冰浴终止反应，离心，取上清液1mL，加入3mL都氏试剂，同时取10%SRBC 025mL，加都氏试剂至4mL，充分混匀，作为SRBC半数溶血管。静置约10min，分光光度计于540nm处测OD值。HC50依下式计算。
HC50=样品光密度值SBBC半数溶血时的光密度值×100%
23巨噬细胞吞噬功能测定试验[5]随机取KM小鼠40只，分为给药高、中、低剂量组及阴性对照组，每组10只，雌雄各半。每日按每10g体重给药01mL，连续给药30d，采用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞（半体内法）进行实验，鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬浊液1mL，放置30min，脱颈处死小鼠，剪开腹壁皮肤，腹腔注射生理盐水2mL揉搓腹腔1min，吸出腹腔洗液，滴于载玻片上，放入垫有纱布的铁质饭盒内，移至37℃二氧化碳恒温培养箱孵育30min。孵毕，用生理盐水洗去未贴壁细胞。以4%（v/v）Giemsa-磷酸缓冲液染色30s，蒸馏水洗净。油镜下计数巨噬细胞，分别记录吞噬的巨噬细胞数，被吞噬的鸡红细胞数及巨噬细胞总数。依下式计算吞噬百分率及吞噬指数。
吞噬百分率（%）=
吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数计数的巨噬细胞数×100%
吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数计数的巨噬细胞数
24止血试验随机取KM小鼠50只，分为给药高、中、低剂量组及阳性、阴性对照组，每组10只，雌雄各半。每日按每10g体重给药01mL，连续给药7d，末次给药30min后，小白鼠眼后静脉丛取血，立即滴于载玻片，同时以秒表计时。每隔10s用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动一次，并观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝止，为凝血时间。 25统计学方法采用SPSS 220软件分析数据，计量资料用均数加减标准差（x±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析，方差齐行Dunnett-t检验，方差不齐行Dunnett-T3检验，P<005表示差异有统计学意义。
3结果
31血清溶血素测定与阴性对照组相比，高剂量组血清溶血素非常显著增加（P<001），中剂量组也显著升高（P<005）。表明海南野扇花对小鼠体液免疫具有增加作用，能增加机体抗体的产生能力。详见表1。
32巨噬细胞吞噬功能测定与阴性对照组相比，高，中剂量组小鼠巨噬细胞吞噬率及吞噬指数均非常显著高于阴性对照组（P<001），表明海南野扇花对小鼠巨噬细胞具有正向刺激作用，详见表2。
33止血试验给药高中剂量组均能非常显著的缩短小鼠凝血时间（P<001），且凝血效果与阳性对照组云南白药无明显差异。表明海南野扇花具有不错的止血药效。详见表3。
4讨论
海南野扇花是黎族民间处方的常用药之一，多用于活血化瘀，主治跌打损伤、消炎止痛等。活血化瘀的活性通常与机体吞噬细胞功能有关，皮下毛细血管破裂，內出血的血瘀块通常由巨噬细胞进行清除，因此活血化瘀的药材往往有活化巨噬细胞的功效[6]。血清溶血素的测定主要考察抗体生成数量，试验结果表明海南野扇花能够提升抗体生成数，说明海南野扇花具有抗感染的功效，止血试验说明海南野扇花具有良好的止血能力，与云南白药相仿。
海南野扇花的主要化学成分为帕其沙明A、矮陀陀碱F、海南野扇花碱A～D、富贵草碱A、H等[7-8]，其中矮坨坨碱、富贵草碱、海南野扇花碱等化合物在同属植物清香桂中可见，富贵草、金丝矮陀陀中则同时含有矮陀陀碱及富贵草碱。而矮陀陀本身是壮药中的重要药材，被形容为“千药万药，不如矮陀陀”[9]。可见清香桂、富贵草、矮陀陀的共有成分是它们药理药效作用的主要化学成分。由于黄杨属、富贵草属及野扇花属植物基本具有相似的功效，推测主要的活性成分是矮陀陀碱及富贵草碱，海南野扇花碱是否具有类似的活性成分还需要更进一步与富贵草、金丝矮陀陀进行比对研究才可知。
研究表明了海南野扇花的抗炎止血、活血化瘀功效可能通过提升体液免疫，巨噬细胞活性和激活凝血因子实现，是一种有潜力的治疗跌打扭伤药材。
参考文献
[1]中南民族学院本书编辑组.海南岛黎族社会调查[M].南宁：广西民族出版社，1992：1-89.
[2]郑希龙， 甘炳春， 孙伟，等. “材”类黎药资源的传统利用[J]. 世界科学技术：中医药现代化， 2014（2）：313-318.
[3]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第四十五卷第一分册）[M].北京：科学出版社，1980：16.
[4]徐叔云. 药理实验方法学[M].3版.北京：人民卫生出版社， 2002： 202-203.
[5]中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范（2003版）[S].2003：701-703.
[6]李正本， 于明鹤， 王国辉. 中草药对免疫功能的影响[J]. 广东畜牧兽医科技， 2006， 31（3）：18-19.
[7]庚石山， 丛浦珠. 海南野扇花中甾体生物碱的化学研究[J]. 药学学报， 1997，（11）：852-856.
[8]邹忠梅. 海南野扇花和韭子的化学成分及质谱-质谱研究[D]. 北京：中国协和医科大学， 1998.
[9]马雯芳， 唐玉荣， 颜萍花，等. 壮药矮陀陀中总生物碱含量测定条件优选及不同产地药材含量比较[J]. 中国药房， 2016（4）：476-478.
【关键词】黎药；海南野扇花；免疫功能；止血
【中图分类号】R29【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）05-0046-03
黎族在海南具有3000多年的生活史[1]，为了生存和繁衍，黎族人依托海南独特的热带资源气候，逐渐探索和实践出了丰富的具有民族特色医药知识[2]。海南野扇花（Sarcococca vagans Stapf）为黄杨科野扇花属植物，主要分布于我国海南、云南、广西等地区[3]。报道集中于海南野扇花的化学成分研究，未见药理药效方面研究。海南民间用以活血化瘀，消炎止痛，常用于跌打损伤后的止血及瘀血祛除，以及咽喉肿痛、风热感冒的消炎止痛。研究参考黎族民间常用用法，考虑其具有止血、提升巨噬细胞吞噬血块的能力，同时可能具有提高免疫力，增强抵抗力的作用。故设计免疫力功能试验及止血试验，为今后开发新药提供一定的研究数据。
1仪器与材料
11实验动物KM小鼠，体重18～22g，雌雄各半，由海南省实验动物中心提供，许可证号SCXK（琼）2015-0007；动物饲养于海南省药物研究所SPF动物房，使用许可证号：SYXK（瓊）2014-0025。
12药物海南野扇花由五指山海南黎族民间医药研究协会提供，经海南省药物研究所鉴定；云南白药（批号：ZBA1505，云南白药集团股份有限公司）。
13仪器二氧化碳培养箱、十万分之一天平、离心机、紫外分光光度计、显微镜、手术器械。
14试剂Hank′s液（20150604，Biohao Biotechnology CoLtd）；PBS缓冲液（批号：20150629，Biohao）；SRBC（批号：20150806，鸿泉生物）；SA缓冲液（批号：20150811，Biohao）；瑞姬氏染液（批号：上海源叶生物科技）；都氏试剂（批号：D5941-6VL，SIGMA）。
2方法
21分组与给药海南野扇花的推荐剂量为成人（体重70kg）每日50g生药量，依据体重换算系数[4]，20g标准小鼠等效剂量为170×00026=013g，即等效小鼠剂量65g/kg，设置为给药中剂量组，高低剂量组分别为等效剂量2倍和05倍，即高、中、低剂量组分别为每日13、65、33g/kg。
将海南野扇花干品粉碎，取130g药材粉加8倍量纯化水浸泡2h，大火煎煮30min，过滤收集滤液，剩余药材再加8倍量水重复煎煮，合并滤液，浓缩至100mL（含生药13g/mL）用于高剂量组。中剂量及低剂量给药组分别为高剂量给药组稀释2倍及4倍。小鼠按每10g体重给药01mL给药，每日一次。
阳性对照组：云南白药胶囊，用纯化水配置为00026g/mL溶液，小鼠按每10g体重给药01mL，1次/d。阴性对照组：等量纯化水，每日按10g体重给药01mL。
22血清溶血素测定试验[5]随机取KM小鼠40只，分为给药高、中、低剂量组及阴性对照组，每组10只，雌雄各半。每日按每10g体重给药01mL，连续给药30d，采用半数溶血值（HC50）的测定方法进行实验。结束前4d以2%（v/v）浓度的绵羊血红细胞（SRBC）免疫小鼠，4d后，小鼠采血分离血清，用SA缓冲溶液稀释200倍，取稀释后血清1mL放入试管内，加入10% SRBC 05mL和1∶8稀释的豚鼠血清补体1mL。另设置不加血清的对照管。置于37℃恒温水浴箱内水浴30min，立即冰浴终止反应，离心，取上清液1mL，加入3mL都氏试剂，同时取10%SRBC 025mL，加都氏试剂至4mL，充分混匀，作为SRBC半数溶血管。静置约10min，分光光度计于540nm处测OD值。HC50依下式计算。
HC50=样品光密度值SBBC半数溶血时的光密度值×100%
23巨噬细胞吞噬功能测定试验[5]随机取KM小鼠40只，分为给药高、中、低剂量组及阴性对照组，每组10只，雌雄各半。每日按每10g体重给药01mL，连续给药30d，采用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞（半体内法）进行实验，鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬浊液1mL，放置30min，脱颈处死小鼠，剪开腹壁皮肤，腹腔注射生理盐水2mL揉搓腹腔1min，吸出腹腔洗液，滴于载玻片上，放入垫有纱布的铁质饭盒内，移至37℃二氧化碳恒温培养箱孵育30min。孵毕，用生理盐水洗去未贴壁细胞。以4%（v/v）Giemsa-磷酸缓冲液染色30s，蒸馏水洗净。油镜下计数巨噬细胞，分别记录吞噬的巨噬细胞数，被吞噬的鸡红细胞数及巨噬细胞总数。依下式计算吞噬百分率及吞噬指数。
吞噬百分率（%）=
吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数计数的巨噬细胞数×100%
吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数计数的巨噬细胞数
24止血试验随机取KM小鼠50只，分为给药高、中、低剂量组及阳性、阴性对照组，每组10只，雌雄各半。每日按每10g体重给药01mL，连续给药7d，末次给药30min后，小白鼠眼后静脉丛取血，立即滴于载玻片，同时以秒表计时。每隔10s用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动一次，并观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝止，为凝血时间。 25统计学方法采用SPSS 220软件分析数据，计量资料用均数加减标准差（x±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析，方差齐行Dunnett-t检验，方差不齐行Dunnett-T3检验，P<005表示差异有统计学意义。
3结果
31血清溶血素测定与阴性对照组相比，高剂量组血清溶血素非常显著增加（P<001），中剂量组也显著升高（P<005）。表明海南野扇花对小鼠体液免疫具有增加作用，能增加机体抗体的产生能力。详见表1。
32巨噬细胞吞噬功能测定与阴性对照组相比，高，中剂量组小鼠巨噬细胞吞噬率及吞噬指数均非常显著高于阴性对照组（P<001），表明海南野扇花对小鼠巨噬细胞具有正向刺激作用，详见表2。
33止血试验给药高中剂量组均能非常显著的缩短小鼠凝血时间（P<001），且凝血效果与阳性对照组云南白药无明显差异。表明海南野扇花具有不错的止血药效。详见表3。
4讨论
海南野扇花是黎族民间处方的常用药之一，多用于活血化瘀，主治跌打损伤、消炎止痛等。活血化瘀的活性通常与机体吞噬细胞功能有关，皮下毛细血管破裂，內出血的血瘀块通常由巨噬细胞进行清除，因此活血化瘀的药材往往有活化巨噬细胞的功效[6]。血清溶血素的测定主要考察抗体生成数量，试验结果表明海南野扇花能够提升抗体生成数，说明海南野扇花具有抗感染的功效，止血试验说明海南野扇花具有良好的止血能力，与云南白药相仿。
海南野扇花的主要化学成分为帕其沙明A、矮陀陀碱F、海南野扇花碱A～D、富贵草碱A、H等[7-8]，其中矮坨坨碱、富贵草碱、海南野扇花碱等化合物在同属植物清香桂中可见，富贵草、金丝矮陀陀中则同时含有矮陀陀碱及富贵草碱。而矮陀陀本身是壮药中的重要药材，被形容为“千药万药，不如矮陀陀”[9]。可见清香桂、富贵草、矮陀陀的共有成分是它们药理药效作用的主要化学成分。由于黄杨属、富贵草属及野扇花属植物基本具有相似的功效，推测主要的活性成分是矮陀陀碱及富贵草碱，海南野扇花碱是否具有类似的活性成分还需要更进一步与富贵草、金丝矮陀陀进行比对研究才可知。
研究表明了海南野扇花的抗炎止血、活血化瘀功效可能通过提升体液免疫，巨噬细胞活性和激活凝血因子实现，是一种有潜力的治疗跌打扭伤药材。
参考文献
[1]中南民族学院本书编辑组.海南岛黎族社会调查[M].南宁：广西民族出版社，1992：1-89.
[2]郑希龙， 甘炳春， 孙伟，等. “材”类黎药资源的传统利用[J]. 世界科学技术：中医药现代化， 2014（2）：313-318.
[3]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第四十五卷第一分册）[M].北京：科学出版社，1980：16.
[4]徐叔云. 药理实验方法学[M].3版.北京：人民卫生出版社， 2002： 202-203.
[5]中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范（2003版）[S].2003：701-703.
[6]李正本， 于明鹤， 王国辉. 中草药对免疫功能的影响[J]. 广东畜牧兽医科技， 2006， 31（3）：18-19.
[7]庚石山， 丛浦珠. 海南野扇花中甾体生物碱的化学研究[J]. 药学学报， 1997，（11）：852-856.
[8]邹忠梅. 海南野扇花和韭子的化学成分及质谱-质谱研究[D]. 北京：中国协和医科大学， 1998.
[9]马雯芳， 唐玉荣， 颜萍花，等. 壮药矮陀陀中总生物碱含量测定条件优选及不同产地药材含量比较[J]. 中国药房， 2016（4）：476-478.