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针对显微镜自动聚焦时传统的图像清晰度评价算法容易受外界因素的干扰进而影响自动聚焦的精度和速度的问题,在对常用的基于图像梯度的清晰度评价算法及其他算法的研究基础上,提出了一种结合了Variance函数与Brenner函数的优点新的图像清晰度评价算法,建立其数学模型,并与传统的Brenner函数、Tenengrad函数等进行仿真对比。分析了噪声的影响,验证了高斯及中值滤波去除噪声的效果。仿真结果表明提出的图像清晰度评价算法计算量小,鲁棒性强,精度高。