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摘要：用MPN法测定不同水分管理、硝化抑制剂条件下稻田土壤硝化菌、亚硝化菌及反硝化菌的数量变化。水分含量较高（110％WFPS）时，反硝化细菌含量较高，达到160万个/g干土；硝化细菌、亚硝化细菌受到抑制，分别只有2.4万个/g干土、0.49万个/g干土。水分较低（60％WFPS）时，反硝化细菌含量减少显著，仅为17万个/g干土；而硝化细菌、亚硝化细菌迅速增加，分别达到35万个/g干土、3.5万个/g干土。双氰胺对稻田土壤亚硝化菌抑制显著，高浓度（2%）的双氰胺对硝化菌也有明显的抑制作用，而对土壤反硝化菌仅有轻微抑制。
关键词：硝化菌 亚硝化菌 反硝化菌 双氰胺
Abstract:The nitrobacteria, nitrosobacteria and denitrifying bacteria population were determinded inpaddy soil under different moisture conditions and nitrification inhibitors by MPN enumeration method.The results of which are 1.6×106 denitrifying bacteria,2.4×104 nitrobacteria and 4.9×103 nitrosobacteria per gram in dry soilunder 110%WFPS and 1.7×105 denitrifying bacteria,3.5×105nitrobacteria and 3.5×104 nitrosobacteria per gram in dry soil under 60%WFPS indicated that the number of denitrifying bacteria was very enormous under110%WFPS,but, nitrobacteria and nitrosobateria was restrained.Denitrifying bacteria reduced repidly under 60%WFPS, whereas ,nitrobacteria and nitrosobateria quickly increased. Dicyandiamide could restrain nitrosobacteria significantly,and nitrobacteriawould also be remarkably restrained under high dicyandiamide concentration,while denitrifying bacteria slightly.
Key words: nitrobacteria，nitrosobacteria，denitrifying bacteria，dicyandiamide
中图分类号： TQ352 文献标识码： A 文章编号：
1.简介
氧化亚氮（N20）作为大气的微量气体成分之一，近年来受到全球性的关注。这是因为N20除了具有吸收红外线的性质，能减少地表通过大气向外空的热輻射，进而导致温室效应外，还表现为在平流层中的N20可与D电离层的氧原子发生反应生成NO，并进一步与同温层的臭氧（O3）发生反应，从而消耗O3，破坏臭氧层，导致到达地球表面的紫外辐射增强，使人类的生存健康受到影响。因此，N20在大气中浓度的增加及其排放影响因素倍受关注。[2-5]
在生物形成N20的过程中，微生物的硝化和反硝化作用被认为是最基本的机理。参与硝化、反硝化过程的微生物类群主要包括：硝化细菌、反硝化细菌等。土壤中N20的产生主要来源于土壤微生物参与下的硝化及反硝化反应。各种不同的自然条件大都通过影响微生物的数量和活性来影响土壤N20的释放。[6]
土壤含水量很低、长期淹水不利于硝化、反硝化细菌的生长。对稻田土壤来说，土壤水分含水量始终处于较高或很高的状态，这时土壤通气性就有可能成为微生物活性最重要的制约因素。[10]在无降雨或降雨量较少期间，土壤含水量适中，通气性良好，土壤硝化作用及反硝化作用都能以较高速率进行且以N20为主要产物。当降雨量大时，土壤由于持续淹水而处于缺氧和强还原状态，N20的产生以反硝化为主，但这时反硝化作用产生的N20可N20还原酶还原为N2，加上水层对N20向大气扩散的及对N20的少量溶解，所以这段期间稻田向大气排放的N20量很少。
在特定条件下，硝化作用是导致N20、NO生成的主要微生物途径。亚硝化单胞菌属在厌气条件下产生N20，表明硝化作用不是N20的直接来源。通气土壤，亚硝化单胞菌属细菌利用NO2-—作为最终电子受体产生N20。缺乏NO3-，微生物可能还原更多的N20。根分泌物通过消耗根际氧，产生厌气环境，可刺激反硝化作用。
此外，植物与土壤的相互作用极大的影响着土壤-植物系统中N20的释放。一方面植物根系及根系分泌物一定程度上改变了土壤的物理化学性质，促进了土
壤中的微生物过程和N20的产生。[17]研究表明，根的生长不但消耗02、NO3-、NH4+和水，还能改变土壤结构，分泌有机酸改变根系PH，并提供有机碳化物刺激微生物活动。另一方面，植物根系残落物和分泌物还会导致根际反硝化强度的增加，反硝化微生物的活性与根区含碳物质的浓度密切相关。[18]水稻根有着明显的向外泌氧的过程，能够提高周围环境的氧化还原电位，进而影响到硝化细菌、反硝化细菌的增长、繁殖。[19-21]
目前，对于各种处理条件下稻田土壤N20的排放通量变化及影响因子有较详尽的报道。其中硝化-反硝化作用过程的微生物机理还没有深入的认识，关于土壤中N20排放量与微生物菌群和数量的关系研究的较少。本实验初步探讨不同水肥条件下稻田土壤中氮循环细菌菌群的数量变化，对土壤N20释放的生物学机理研究具有重要意义。[22]
2.材料与方法
2.1试供土壤
试验土壤取自浙江大学农场水稻田，土壤理化性质如下：有机质：2.8％，pH值：7.95，采样后将稻田土壤风干、磨细，过2mm筛备用。
2.2处理与培养
2.2.1处理
实验分为两组：低浓度DCD（0.4mg/培养）、高浓度DCD（2mg/培养），每组试验设4种不同的水分管理模式：淹水（110％WFPS）、临界饱和水（95％WFPS）、模拟旱地水分（60％WFPS）以及水旱交替（95－60％WFPS），WFPS表示的是土壤孔隙充水率。每种水分条件设2种施肥方式：施肥（9.9mg尿素/培养，相当于154mg－N/kg）、不施肥。
2.2.2培养
称取30g过2mm筛的风干土样放入250ml有密封盖的培养器中，在30℃下恒温培养。双氰胺与尿素配制成溶液后一起加入。培养过程中，培养器敞开。干湿交替处理为7天湿（95％WFPS）,7天旱（60％WFPS）交替管理。
2.3采样与接种
每组培养在预培养的第5天取样，水分交替的培养在交替前、后3天采样接种。其他培养在正式培养的第7天采样接种。采样的新鲜土样制成10-1至10-5的土壤悬浮液，摇匀，分别接种于硝化细菌培养基、亚硝酸氧化细菌培养基和反硝化细菌培养基，置于生化培养箱内培养。
3.结果与讨论
3.1 水分条件对硝化细菌、亚硝化细菌和反硝化细菌的影响
实验证明，硝化细菌、亚硝化细菌、反硝化细菌的数量主要决定于土壤水分含量。水分含量较高（110％WFPS）时，稻田土壤中硝化细菌、亚硝化细菌含量很少，分别只有2.4万个/g干土、0.49万个/g干土，而反硝化细菌含量却很高，达到160万个/g干土。当水分含量较低（60％WFPS）时，情况相反，稻田土壤中硝化细菌、亚硝化细菌含量很高，分别达到35万个/g干土、3.5万个/g干土，是水分含量为110％WFPS时硝化细菌量的15倍 、水分含量为110％WFPS时亚硝化细菌的7倍；反硝化细菌仅为17万个/g干土，只有水分含量为110％WFPS时 的十分之一。由此看出，稻田土壤水分含量的多少与硝化细菌、亚硝化细菌及反硝化细菌的数量有直接关系，是决定土壤中硝化细菌、亚硝化细菌及反硝化细菌的数量变化的主要因素。土壤含水量较高（110％WFPS）时，土壤透气性降低，处于缺氧状态，环境中氧化还原电位极低，硝化细菌、亚硝化细菌由于缺乏电子受体而受到抑制。同时，由于高水分条件造成的厌氧环境抑制硝化细菌的NH4+单氧化酶的活性[5]，造成了土壤中硝化细菌、亚硝化细菌的数量和活性均较低，硝化作用十分微弱。但是，高水分条件造成的厌氧还原状态解除了反硝化细菌的氧毒害作用，促进反硝化细菌的生长和繁殖，使得反硝化细菌数量迅速增加。土壤水分含量低（60％WFPS）时，土壤通透性好，土壤氧化还原电位较高，处于氧化状态，硝化细菌、亚硝化细菌数量迅速增加。高氧化还原电位抑制了反硝化细菌的生长，反硝化细菌数量含量急剧减少。
从绝对数量上看，亚硝化细菌在水分适宜（60％WFPS）时最大数量为3.5万个/g干土数量，大大低于硝化细菌和反硝化细菌的数量。这可能与NO2－在土壤中容易转化、不易积累有关，由于NO2－的缺乏，使得亚硝化细菌能源供应不足，抑制了亚硝化细菌数量的增加。
3.2 双氰胺对硝化菌、亚硝化菌和反硝化菌的影响
图1在不同双氰胺浓度下稻田土壤硝化细菌数量的变化
图2在不同双氰胺浓度下稻田土壤亚硝化细菌数量的变化
图3在不同双氰胺浓度下稻田土壤反硝化细菌数量的变化
由实验数据绘图结果可看出，低浓度的双氰胺（0. 5%）对土壤硝化细菌影响不明显，高浓度的双氰胺（2%）却能够明显抑制硝化细菌的數量，一般会降低一个数量级左右。这可能与双氰胺中的氰基和细菌呼吸酶中的硫氢基或金属基团的反应有关。低浓度的双氰胺（0. 5%）对土壤亚硝化菌较为明显，高浓度的双氰胺（2%）对亚硝化菌的抑制作用十分强烈，在60％WFPS水分条件下，2%双氰胺能够使得土壤亚硝化细菌数量降低达1.5个数量级。低浓度的双氰胺（0. 5%）对反硝化菌仅有轻微抑制，高浓度的双氰胺（2%）使这种抑制作用略有增加。双氰胺对硝化作用的抑制引起阻断了NH4＋向NO3－的转化，土壤中的NO3－浓度降低，反硝化作用反应底物减少，从而造成了对反硝化细菌的抑制。
4.结论与展望
结论：
1.硝化细菌、亚硝化细菌、反硝化细菌主要决定于土壤水分含量。水分含量较高时，土壤处于还原状态，反硝化细菌含量较高，硝化细菌、亚硝化细菌受到抑制；水分含量较低时，土壤处于氧化状态，反硝化细菌含量减少，硝化细菌、亚硝化细菌迅速增加。硝化细菌、亚硝化细菌、反硝化细菌主要决定于土壤水分含量。水分含量较高时，土壤处于还原状态，反硝化细菌含量较高，硝化细菌、亚硝化细菌受到抑制；水分含量较低时，土壤处于氧化状态，反硝化细菌含量减少，硝化细菌、亚硝化细菌迅速增加。侯爱新等对水稻田水分含量变化的试验也表明，土壤含水量较高的淹水期，由于淹水造成的厌氧环境可以抑制硝化细菌的NH4+单氧化酶的活性，同时，反硝化作用则由于氧化还原电位降至0以下，代谢产物主要以N2为主，几乎没有N20的净排放。而落干期，由于可得性氧气增多，硝化细菌酶活性抑制被解除，反硝化作用中N20还原酶活性开始受到抑制，代谢产物中，N20/ N2的比例增大。[7-9]
双氰胺对稻田土壤亚硝化菌产生显著抑制。
低浓度的双氰胺（0. 5%）对土壤硝化细菌抑制不显著，高浓度的双氰胺（2%）却能够明显抑制硝化细菌的数量，一般会降低一个数量级左右。
双氰胺对土壤反硝化菌仅有轻微抑制，可能是由于双氰胺对硝化作用NO2-氧化为N03-的抑制，引起作为反硝化作用反应底物N03-减少。
展望：
目前，对已经开展了对硝化反硝化过程中各种酶的作用机理研究，但是，研究不够深入，对于各种酶的生化结构、作用机理、不同条件下的酶活性及原因等还有待进一步作深入研究。
2、分子生物学的方法对土壤中硝化、亚硝化、反硝化等氮循环细菌进行在不同条件下细菌种群、数量变化、生化特性、分布、活性等进行研究。从微生物学的角度探讨稻田土壤中氧化亚氮的形成、释放机理。
参考文献
[1]齐玉春，董云社，土壤氧化亚氮产生、排放及其影响因素。地理学报，1999，（6）：534-542。
[2] 杜睿，王庚辰，吕达仁，内蒙古典型草原土壤N2O产生的机理探讨。中国环境科学，2000，20（5）：387-391。
[3] Mocarty,G.W.andJ.M.Bremmer,Commun.Soil Sci.Plant Anal,1989,20:2049-2065.
[4] 杜玲玲，双氰胺的硝化抑制作用及其应用。土壤学进展，1994，20（4）：26-31。
关键词：硝化菌 亚硝化菌 反硝化菌 双氰胺
Abstract:The nitrobacteria, nitrosobacteria and denitrifying bacteria population were determinded inpaddy soil under different moisture conditions and nitrification inhibitors by MPN enumeration method.The results of which are 1.6×106 denitrifying bacteria,2.4×104 nitrobacteria and 4.9×103 nitrosobacteria per gram in dry soilunder 110%WFPS and 1.7×105 denitrifying bacteria,3.5×105nitrobacteria and 3.5×104 nitrosobacteria per gram in dry soil under 60%WFPS indicated that the number of denitrifying bacteria was very enormous under110%WFPS,but, nitrobacteria and nitrosobateria was restrained.Denitrifying bacteria reduced repidly under 60%WFPS, whereas ,nitrobacteria and nitrosobateria quickly increased. Dicyandiamide could restrain nitrosobacteria significantly,and nitrobacteriawould also be remarkably restrained under high dicyandiamide concentration,while denitrifying bacteria slightly.
Key words: nitrobacteria，nitrosobacteria，denitrifying bacteria，dicyandiamide
中图分类号： TQ352 文献标识码： A 文章编号：
1.简介
氧化亚氮（N20）作为大气的微量气体成分之一，近年来受到全球性的关注。这是因为N20除了具有吸收红外线的性质，能减少地表通过大气向外空的热輻射，进而导致温室效应外，还表现为在平流层中的N20可与D电离层的氧原子发生反应生成NO，并进一步与同温层的臭氧（O3）发生反应，从而消耗O3，破坏臭氧层，导致到达地球表面的紫外辐射增强，使人类的生存健康受到影响。因此，N20在大气中浓度的增加及其排放影响因素倍受关注。[2-5]
在生物形成N20的过程中，微生物的硝化和反硝化作用被认为是最基本的机理。参与硝化、反硝化过程的微生物类群主要包括：硝化细菌、反硝化细菌等。土壤中N20的产生主要来源于土壤微生物参与下的硝化及反硝化反应。各种不同的自然条件大都通过影响微生物的数量和活性来影响土壤N20的释放。[6]
土壤含水量很低、长期淹水不利于硝化、反硝化细菌的生长。对稻田土壤来说，土壤水分含水量始终处于较高或很高的状态，这时土壤通气性就有可能成为微生物活性最重要的制约因素。[10]在无降雨或降雨量较少期间，土壤含水量适中，通气性良好，土壤硝化作用及反硝化作用都能以较高速率进行且以N20为主要产物。当降雨量大时，土壤由于持续淹水而处于缺氧和强还原状态，N20的产生以反硝化为主，但这时反硝化作用产生的N20可N20还原酶还原为N2，加上水层对N20向大气扩散的及对N20的少量溶解，所以这段期间稻田向大气排放的N20量很少。
在特定条件下，硝化作用是导致N20、NO生成的主要微生物途径。亚硝化单胞菌属在厌气条件下产生N20，表明硝化作用不是N20的直接来源。通气土壤，亚硝化单胞菌属细菌利用NO2-—作为最终电子受体产生N20。缺乏NO3-，微生物可能还原更多的N20。根分泌物通过消耗根际氧，产生厌气环境，可刺激反硝化作用。
此外，植物与土壤的相互作用极大的影响着土壤-植物系统中N20的释放。一方面植物根系及根系分泌物一定程度上改变了土壤的物理化学性质，促进了土
壤中的微生物过程和N20的产生。[17]研究表明，根的生长不但消耗02、NO3-、NH4+和水，还能改变土壤结构，分泌有机酸改变根系PH，并提供有机碳化物刺激微生物活动。另一方面，植物根系残落物和分泌物还会导致根际反硝化强度的增加，反硝化微生物的活性与根区含碳物质的浓度密切相关。[18]水稻根有着明显的向外泌氧的过程，能够提高周围环境的氧化还原电位，进而影响到硝化细菌、反硝化细菌的增长、繁殖。[19-21]
目前，对于各种处理条件下稻田土壤N20的排放通量变化及影响因子有较详尽的报道。其中硝化-反硝化作用过程的微生物机理还没有深入的认识，关于土壤中N20排放量与微生物菌群和数量的关系研究的较少。本实验初步探讨不同水肥条件下稻田土壤中氮循环细菌菌群的数量变化，对土壤N20释放的生物学机理研究具有重要意义。[22]
2.材料与方法
2.1试供土壤
试验土壤取自浙江大学农场水稻田，土壤理化性质如下：有机质：2.8％，pH值：7.95，采样后将稻田土壤风干、磨细，过2mm筛备用。
2.2处理与培养
2.2.1处理
实验分为两组：低浓度DCD（0.4mg/培养）、高浓度DCD（2mg/培养），每组试验设4种不同的水分管理模式：淹水（110％WFPS）、临界饱和水（95％WFPS）、模拟旱地水分（60％WFPS）以及水旱交替（95－60％WFPS），WFPS表示的是土壤孔隙充水率。每种水分条件设2种施肥方式：施肥（9.9mg尿素/培养，相当于154mg－N/kg）、不施肥。
2.2.2培养
称取30g过2mm筛的风干土样放入250ml有密封盖的培养器中，在30℃下恒温培养。双氰胺与尿素配制成溶液后一起加入。培养过程中，培养器敞开。干湿交替处理为7天湿（95％WFPS）,7天旱（60％WFPS）交替管理。
2.3采样与接种
每组培养在预培养的第5天取样，水分交替的培养在交替前、后3天采样接种。其他培养在正式培养的第7天采样接种。采样的新鲜土样制成10-1至10-5的土壤悬浮液，摇匀，分别接种于硝化细菌培养基、亚硝酸氧化细菌培养基和反硝化细菌培养基，置于生化培养箱内培养。
3.结果与讨论
3.1 水分条件对硝化细菌、亚硝化细菌和反硝化细菌的影响
实验证明，硝化细菌、亚硝化细菌、反硝化细菌的数量主要决定于土壤水分含量。水分含量较高（110％WFPS）时，稻田土壤中硝化细菌、亚硝化细菌含量很少，分别只有2.4万个/g干土、0.49万个/g干土，而反硝化细菌含量却很高，达到160万个/g干土。当水分含量较低（60％WFPS）时，情况相反，稻田土壤中硝化细菌、亚硝化细菌含量很高，分别达到35万个/g干土、3.5万个/g干土，是水分含量为110％WFPS时硝化细菌量的15倍 、水分含量为110％WFPS时亚硝化细菌的7倍；反硝化细菌仅为17万个/g干土，只有水分含量为110％WFPS时 的十分之一。由此看出，稻田土壤水分含量的多少与硝化细菌、亚硝化细菌及反硝化细菌的数量有直接关系，是决定土壤中硝化细菌、亚硝化细菌及反硝化细菌的数量变化的主要因素。土壤含水量较高（110％WFPS）时，土壤透气性降低，处于缺氧状态，环境中氧化还原电位极低，硝化细菌、亚硝化细菌由于缺乏电子受体而受到抑制。同时，由于高水分条件造成的厌氧环境抑制硝化细菌的NH4+单氧化酶的活性[5]，造成了土壤中硝化细菌、亚硝化细菌的数量和活性均较低，硝化作用十分微弱。但是，高水分条件造成的厌氧还原状态解除了反硝化细菌的氧毒害作用，促进反硝化细菌的生长和繁殖，使得反硝化细菌数量迅速增加。土壤水分含量低（60％WFPS）时，土壤通透性好，土壤氧化还原电位较高，处于氧化状态，硝化细菌、亚硝化细菌数量迅速增加。高氧化还原电位抑制了反硝化细菌的生长，反硝化细菌数量含量急剧减少。
从绝对数量上看，亚硝化细菌在水分适宜（60％WFPS）时最大数量为3.5万个/g干土数量，大大低于硝化细菌和反硝化细菌的数量。这可能与NO2－在土壤中容易转化、不易积累有关，由于NO2－的缺乏，使得亚硝化细菌能源供应不足，抑制了亚硝化细菌数量的增加。
3.2 双氰胺对硝化菌、亚硝化菌和反硝化菌的影响
图1在不同双氰胺浓度下稻田土壤硝化细菌数量的变化
图2在不同双氰胺浓度下稻田土壤亚硝化细菌数量的变化
图3在不同双氰胺浓度下稻田土壤反硝化细菌数量的变化
由实验数据绘图结果可看出，低浓度的双氰胺（0. 5%）对土壤硝化细菌影响不明显，高浓度的双氰胺（2%）却能够明显抑制硝化细菌的數量，一般会降低一个数量级左右。这可能与双氰胺中的氰基和细菌呼吸酶中的硫氢基或金属基团的反应有关。低浓度的双氰胺（0. 5%）对土壤亚硝化菌较为明显，高浓度的双氰胺（2%）对亚硝化菌的抑制作用十分强烈，在60％WFPS水分条件下，2%双氰胺能够使得土壤亚硝化细菌数量降低达1.5个数量级。低浓度的双氰胺（0. 5%）对反硝化菌仅有轻微抑制，高浓度的双氰胺（2%）使这种抑制作用略有增加。双氰胺对硝化作用的抑制引起阻断了NH4＋向NO3－的转化，土壤中的NO3－浓度降低，反硝化作用反应底物减少，从而造成了对反硝化细菌的抑制。
4.结论与展望
结论：
1.硝化细菌、亚硝化细菌、反硝化细菌主要决定于土壤水分含量。水分含量较高时，土壤处于还原状态，反硝化细菌含量较高，硝化细菌、亚硝化细菌受到抑制；水分含量较低时，土壤处于氧化状态，反硝化细菌含量减少，硝化细菌、亚硝化细菌迅速增加。硝化细菌、亚硝化细菌、反硝化细菌主要决定于土壤水分含量。水分含量较高时，土壤处于还原状态，反硝化细菌含量较高，硝化细菌、亚硝化细菌受到抑制；水分含量较低时，土壤处于氧化状态，反硝化细菌含量减少，硝化细菌、亚硝化细菌迅速增加。侯爱新等对水稻田水分含量变化的试验也表明，土壤含水量较高的淹水期，由于淹水造成的厌氧环境可以抑制硝化细菌的NH4+单氧化酶的活性，同时，反硝化作用则由于氧化还原电位降至0以下，代谢产物主要以N2为主，几乎没有N20的净排放。而落干期，由于可得性氧气增多，硝化细菌酶活性抑制被解除，反硝化作用中N20还原酶活性开始受到抑制，代谢产物中，N20/ N2的比例增大。[7-9]
双氰胺对稻田土壤亚硝化菌产生显著抑制。
低浓度的双氰胺（0. 5%）对土壤硝化细菌抑制不显著，高浓度的双氰胺（2%）却能够明显抑制硝化细菌的数量，一般会降低一个数量级左右。
双氰胺对土壤反硝化菌仅有轻微抑制，可能是由于双氰胺对硝化作用NO2-氧化为N03-的抑制，引起作为反硝化作用反应底物N03-减少。
展望：
目前，对已经开展了对硝化反硝化过程中各种酶的作用机理研究，但是，研究不够深入，对于各种酶的生化结构、作用机理、不同条件下的酶活性及原因等还有待进一步作深入研究。
2、分子生物学的方法对土壤中硝化、亚硝化、反硝化等氮循环细菌进行在不同条件下细菌种群、数量变化、生化特性、分布、活性等进行研究。从微生物学的角度探讨稻田土壤中氧化亚氮的形成、释放机理。
参考文献
[1]齐玉春，董云社，土壤氧化亚氮产生、排放及其影响因素。地理学报，1999，（6）：534-542。
[2] 杜睿，王庚辰，吕达仁，内蒙古典型草原土壤N2O产生的机理探讨。中国环境科学，2000，20（5）：387-391。
[3] Mocarty,G.W.andJ.M.Bremmer,Commun.Soil Sci.Plant Anal,1989,20:2049-2065.
[4] 杜玲玲，双氰胺的硝化抑制作用及其应用。土壤学进展，1994，20（4）：26-31。