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摘要 采用菌丝生长速率法测定了7种不同杀菌剂对降香黄檀和油茶炭疽病菌的室内毒力效果。结果表明，98%溴菌腈对降香黄檀和油茶炭疽病菌菌丝生长的抑制作用最强，EC50值分别为0.019 5 mg/mL和0.001 1 mg/mL；其次是97%吡唑醚菌酯和96.8%苯醚甲环唑；81%氨基寡糖素在供试浓度下几乎无任何抑制活性。
关键词 降香黄檀；油茶；炭疽病菌；杀菌剂；毒力测定
中图分类号 S481 .1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）14-0099-02
Abstract The mycelium growth rate method was used to determine inhibitory effect of the seven different fungicides against Colletotrichun gloeosporioides from Dalbergia odorifera and Camellia oleifera.The results showed that bromoxynil（98%，w） had the strongest inhibitory activity on Colletotrichun gloeosporioides，and the EC50 values were 0.019 5 mg/mL and 0.001 1 mg/mL，respectively.Pyraclostrobine（97%，w） and difenoconazole（96.8%，w） also showed good antifungal activities on the Colletotrichun gloeosporioides.While the amino-oligosaccharin（81%，w） didn′t show any inhibitory activities under the test concentration.
Key words Dalbergia odorifera；Camellia oleifera；Colletotrichun gloeosporioides；fungicide；toxicity measurement
降香黃檀（Dalbergia odorifera L.），俗称黄花梨，为豆科蝶形花亚科黄檀属植物，海南特产，濒危树种，所产木材为上等家具良材，其芯材可生产著名中药材降香，是我国华南地区的珍贵树种，具有极高的经济价值[1-5]。油茶（Camellia oleifera Abel.）又名茶子树、茶油树，是我国南方重要的经济林树种，与油棕、油橄榄和椰子并称“世界四大木本食用油料树种”[6-7]，其种子所制茶油中不饱和脂肪酸含量高，对预防冠心病和动脉粥样硬化均有良好的作用[8-9]。
炭疽病是广泛分布在热带、亚热带甚至温带等地区的一类病害，由炭疽菌属（Colletotrichum）的多种真菌诱发，已确认包括粮食、蔬菜、果树、花卉等在内600多种植物遭受其危害[10]。炭疽病是降香黄檀和油茶最主要的病害，其病原均为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）[11-13]。降香黄檀感病后可导致叶片逐渐干枯或穿孔，直至脱落，严重影响植株光合作用以及芯材的形成，且常大面积暴发，对于降香黄檀行业的可持续发展十分不利[5]。而炭疽病危害油茶后可引起严重落果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株衰亡，在油茶栽培区大面积发生，造成重大经济损失[12，14]。本研究采用菌丝生长速率法测定了不同杀菌剂对降香黄檀和油茶炭疽病菌的室内毒力效果，以期筛选出有效的杀菌剂，为降香黄檀和油茶炭疽病防治提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌种。油茶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporio-ides Penz.）和降香黄檀炭疽病菌[Colletotrichum gloeospori-oides（Penz.） Sacc]均由华南农业大学森林保护教研室提供。上述植物病原真菌菌株长期保存在 4 ℃条件，在活性测定前，需要在PDA平板上对供试真菌进行活化培养（25 ℃，暗培养）5～10 d，然后继代培养1～2次，即可用于活性测定。
1.1.2 供试药剂。98%嘧菌酯、95%啶酰菌胺、98%溴菌腈、96.8%苯醚甲环唑、97%吡唑醚菌酯、81%氨基寡糖素、98%福美双和80%多菌灵，以上药剂均购自中国农科院植保所廊坊农药中试厂，4 ℃避光保存，备用。
1.2 试验方法
1.2.1 含杀菌剂PDA培养基的制备。用30% DMSO配制7种杀菌剂，制成24.000、12.000、6.000、3.000、1.500、0.750、0.375 mg/mL 7个浓度梯度的母液。用移液枪取1 mL母液注入灭菌后冷却至约60 ℃的29 mL PDA 培养基中，轻轻摇匀，均匀倒入3个培养皿中，制成含毒平板。其终浓度依次为0.800 0、0.400 0、0.200 0、0.100 0、0.050 0、0.025 0、0.012 5 mg/mL。
1.2.2 供试化学药剂对炭疽菌菌丝室内毒力的测定。采用菌丝生长速率法中的含毒介质培养法[15]，用直径7 mm的打孔器移取在25 ℃光照培养箱中生长6 d的较为一致的菌落边缘，使菌丝面朝下接种于经不同药剂处理的含毒培养平板中，每个处理3次重复，倒置于25 ℃光照培养箱中培养。以加入无菌水的培养基为空白对照，以加入30% DMSO为阴性对照，以市场常见商品80%多菌灵为阳性对照，每组对照3次重复。待生长7 d后，即空白对照菌落生长至培养皿面积2/3时，采用十字交叉法测量不同处理菌落生长直径，并求出各种化学药剂的抑菌率。 计算公式如下：
抑菌率（%）=（阴性对照纯生长量-处理纯生长量）/阴性对照纯生长量×100；
纯生长量=菌落平均直径-菌饼直径。
1.2.3 毒力分析，建立毒力回归方程。计算出不同浓度下杀菌剂的抑菌率，并将抑菌率根据生物统计几率值换算表换算为几率值，以杀菌剂浓度的对数值为横坐标，以抑菌率几率值为纵坐标在Excel中做XY散点图，并添加趋势图，得出毒力回归方程以及r，并计算出抑菌中浓度EC50（mg/mL），以此表示杀菌剂对降香黄檀和油茶炭疽病菌抑制作用的强弱[16]。
2 结果与分析
2.1 对降香黄檀炭疽菌菌丝的室内毒力测定
不同供试药剂对降香黄檀炭疽病菌的抑制效果见图1、表1。可以看出，98%溴菌腈对降香黄檀炭疽病菌的抑制作用最强，其EC50值为0.019 5 mg/mL；97%吡唑醚菌酯次之，EC50值为0.025 6 mg/mL；81%氨基寡糖素对降香黄檀炭疽病菌抑制作用最差，EC50值>5 mg/mL。
2.2 对油茶炭疽菌菌丝的室内毒力测定
不同供试药剂对降香黄檀炭疽病菌的抑制效果见图2、表2。可以看出，98%溴菌腈对油茶炭疽病菌的抑制作用最强，其EC50值为0.001 1 mg/mL；96.8%苯醚甲環唑和97%吡唑醚菌酯次之，EC50值分别为0.004 2 mg/mL和0.004 3 mg/mL；81%氨基寡糖素对降香黄檀炭疽病菌抑制作用最差，EC50值>5 mg/mL。
3 结论与讨论
试验结果表明，7种供试杀菌剂中，除81%氨基寡糖素外，其他6种供试杀菌剂对降香黄檀和油茶炭疽病菌的生长均有抑制作用，但抑菌效果均不如阳性对照80%多菌灵。7种供试杀菌剂对降香黄檀和油茶炭疽病菌的抑制作用具有相似性，其中抑制作用最强的均是98%溴菌腈，EC50值分别为0.019 5 mg/mL和0.001 1 mg/mL；其次是97%吡唑醚菌酯和96.8%苯醚甲环唑，而81%氨基寡糖素对2种炭疽病菌几乎无抑制作用。
目前，对于炭疽菌属真菌的研究报道较多[17]，但是不同杀菌剂对降香黄檀和油茶炭疽病菌的室内毒力测定研究还较少。本研究结果表明，溴菌腈、苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯等供试药剂具有极强的抑菌效果，这与杨成德等[18]、韦文添[19]对其他种炭疽菌的研究结果类似。溴菌腈又名炭特灵，能抑制和铲除细菌、真菌及藻类的生长，在国内主要应用于农作物病害的防治和鱼塘灭藻及工业废水处理，是目前国内杀菌剂中防治各类作物炭疽病的特效药剂[20]。而苯醚甲环唑又称噁醚唑，为三唑类杀菌剂，通过抑制真菌和细菌的细胞麦角甾醇（是构成细胞膜的重要成分，对细胞膜的理化性质渗透性起重要作用）的生物合成，破坏细胞膜结构与功能，从而达到杀菌目的[21]。炭疽病的防治是一项系统工程，应贯彻“防重于治”的方针，以营林措施为基础，辅之以化学防治，采用综合治理的方针。合理使用杀菌剂只是其中的一种手段，本文的研究结果为以后降香黄檀和油茶炭疽病的防治提供了重要的理论依据。
4 参考文献
[1] 黄培忠，卢立华.珍贵树种降香黄檀[J].广西林业，2004（6）：39.
[2] 姜爱莉，孙利芹.降香抗氧化成分的提取及活性研究[J].精细化工，2004，21（7）：525-528.
[3] 刘荣霞，王巧，毕开顺，等.降香药材色谱指纹图谱的建立及其在药材鉴定中的应用[J].药学学报，2005（11）：48-52.
[4] KANG T H，TIAN Y H，KIM Y C.Isoliquiritigenin：A Competitive 1 Ros-inase Inhibitor from the Heartwood of Dalbergia odorifera[J].Journal of Applied Pharmacology，2005，13（1）：32-34.
[5] 周洁尘，刘君昂，何苑皞，等.13种海南入侵植物提取物对降香黄檀炭疽病菌的抑制作用[J].植物保护，2015，41（5）：54-60.
[6] 陈永忠，王德斌.湖南省油茶良种选育及推广应用概况[J].湖南林业科技，2001，28（3）：25-29.
[7] 邓鑫州，黄连桂，邓荫伟.5 种药剂对油茶炭疽病的防治效果研究[J].安徽农业科学，2011，39（16）：9653-9654.
[8] 徐学兵.茶油研究进展述评[J].中国油脂，1995，20（5）：7-9.
[9] SUN F F，TANG S，LIU R，et al.Biorefining Fractionation of the Camellia oleifera Abel.hull into Diverse Bioproducts with a Two-Stage Organosolv Extraction[J].Industrial Crops and Products，2016，94：790-799.
[10] 韩长志.炭疽菌属真菌分类研究现状及发展趋势[J].中国植保导刊，2015，35（6）：24-30.
[11] CANNON P F，BUDDIE A G.The Typification of Colletotrichum gloeos-porioides[J].Mycotaxon，2008，104：189-204.
[12] 李石磊，刘君昂，赵莹，等.6 种杀菌剂对油茶主要病害的室内毒力测定[J].中南林业科技大学学报，2013，33（9）：60-62.
[13] 桑利伟，刘爱勤， 孙世伟，等.海南降香黄檀炭疽病病原鉴定及防治[J].热带农业科学，2009，29（8）：23-25.
[14] 靳爱仙，周国英，李河.油茶炭疽病的研究现状、问题与方向[J].中国森林病虫，2009，28（2）：27-31.
[15] K？魻LLER W，WILCOX W F，PARKER D M.Sensitivity of Venturia Ina-equalis Populations to Anilinopyrimidine Fungicides and Their Contr-ibution to Scab Management in New York[J].Plant Disease，2005，89：357-365.
[16] 孟昭礼，罗兰，袁中林.人工模拟的植物源杀菌剂银泰防治番茄3 种病害效果研究[J].中国农业科学，2002，35（7）：863-866.
[17] 刘伟.油茶炭疽病的病原学、发病规律及防治技术研究[D].武汉：华中农业大学，2012.
[18] 杨成德，姜红霞.甘肃省马铃薯炭疽病的鉴定及室内药剂筛选[J].植物保护，2012，38（6）：127-133.
[19] 韦文添.不同杀菌剂对辣椒炭疽病菌的室内毒力测定[J].江苏农业科学，2013，41（4）：117-119.
[20] 刘伟.溴菌腈在苹果和土壤中的残留消解动态研究[J].农业环境科学学报，2008，27（2）：792-794.
[21] 华乃震.杀菌剂苯醚甲环唑的进展和应用[J].世界农药，2013，35（6）：7-6.
关键词 降香黄檀；油茶；炭疽病菌；杀菌剂；毒力测定
中图分类号 S481 .1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）14-0099-02
Abstract The mycelium growth rate method was used to determine inhibitory effect of the seven different fungicides against Colletotrichun gloeosporioides from Dalbergia odorifera and Camellia oleifera.The results showed that bromoxynil（98%，w） had the strongest inhibitory activity on Colletotrichun gloeosporioides，and the EC50 values were 0.019 5 mg/mL and 0.001 1 mg/mL，respectively.Pyraclostrobine（97%，w） and difenoconazole（96.8%，w） also showed good antifungal activities on the Colletotrichun gloeosporioides.While the amino-oligosaccharin（81%，w） didn′t show any inhibitory activities under the test concentration.
Key words Dalbergia odorifera；Camellia oleifera；Colletotrichun gloeosporioides；fungicide；toxicity measurement
降香黃檀（Dalbergia odorifera L.），俗称黄花梨，为豆科蝶形花亚科黄檀属植物，海南特产，濒危树种，所产木材为上等家具良材，其芯材可生产著名中药材降香，是我国华南地区的珍贵树种，具有极高的经济价值[1-5]。油茶（Camellia oleifera Abel.）又名茶子树、茶油树，是我国南方重要的经济林树种，与油棕、油橄榄和椰子并称“世界四大木本食用油料树种”[6-7]，其种子所制茶油中不饱和脂肪酸含量高，对预防冠心病和动脉粥样硬化均有良好的作用[8-9]。
炭疽病是广泛分布在热带、亚热带甚至温带等地区的一类病害，由炭疽菌属（Colletotrichum）的多种真菌诱发，已确认包括粮食、蔬菜、果树、花卉等在内600多种植物遭受其危害[10]。炭疽病是降香黄檀和油茶最主要的病害，其病原均为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）[11-13]。降香黄檀感病后可导致叶片逐渐干枯或穿孔，直至脱落，严重影响植株光合作用以及芯材的形成，且常大面积暴发，对于降香黄檀行业的可持续发展十分不利[5]。而炭疽病危害油茶后可引起严重落果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株衰亡，在油茶栽培区大面积发生，造成重大经济损失[12，14]。本研究采用菌丝生长速率法测定了不同杀菌剂对降香黄檀和油茶炭疽病菌的室内毒力效果，以期筛选出有效的杀菌剂，为降香黄檀和油茶炭疽病防治提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌种。油茶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporio-ides Penz.）和降香黄檀炭疽病菌[Colletotrichum gloeospori-oides（Penz.） Sacc]均由华南农业大学森林保护教研室提供。上述植物病原真菌菌株长期保存在 4 ℃条件，在活性测定前，需要在PDA平板上对供试真菌进行活化培养（25 ℃，暗培养）5～10 d，然后继代培养1～2次，即可用于活性测定。
1.1.2 供试药剂。98%嘧菌酯、95%啶酰菌胺、98%溴菌腈、96.8%苯醚甲环唑、97%吡唑醚菌酯、81%氨基寡糖素、98%福美双和80%多菌灵，以上药剂均购自中国农科院植保所廊坊农药中试厂，4 ℃避光保存，备用。
1.2 试验方法
1.2.1 含杀菌剂PDA培养基的制备。用30% DMSO配制7种杀菌剂，制成24.000、12.000、6.000、3.000、1.500、0.750、0.375 mg/mL 7个浓度梯度的母液。用移液枪取1 mL母液注入灭菌后冷却至约60 ℃的29 mL PDA 培养基中，轻轻摇匀，均匀倒入3个培养皿中，制成含毒平板。其终浓度依次为0.800 0、0.400 0、0.200 0、0.100 0、0.050 0、0.025 0、0.012 5 mg/mL。
1.2.2 供试化学药剂对炭疽菌菌丝室内毒力的测定。采用菌丝生长速率法中的含毒介质培养法[15]，用直径7 mm的打孔器移取在25 ℃光照培养箱中生长6 d的较为一致的菌落边缘，使菌丝面朝下接种于经不同药剂处理的含毒培养平板中，每个处理3次重复，倒置于25 ℃光照培养箱中培养。以加入无菌水的培养基为空白对照，以加入30% DMSO为阴性对照，以市场常见商品80%多菌灵为阳性对照，每组对照3次重复。待生长7 d后，即空白对照菌落生长至培养皿面积2/3时，采用十字交叉法测量不同处理菌落生长直径，并求出各种化学药剂的抑菌率。 计算公式如下：
抑菌率（%）=（阴性对照纯生长量-处理纯生长量）/阴性对照纯生长量×100；
纯生长量=菌落平均直径-菌饼直径。
1.2.3 毒力分析，建立毒力回归方程。计算出不同浓度下杀菌剂的抑菌率，并将抑菌率根据生物统计几率值换算表换算为几率值，以杀菌剂浓度的对数值为横坐标，以抑菌率几率值为纵坐标在Excel中做XY散点图，并添加趋势图，得出毒力回归方程以及r，并计算出抑菌中浓度EC50（mg/mL），以此表示杀菌剂对降香黄檀和油茶炭疽病菌抑制作用的强弱[16]。
2 结果与分析
2.1 对降香黄檀炭疽菌菌丝的室内毒力测定
不同供试药剂对降香黄檀炭疽病菌的抑制效果见图1、表1。可以看出，98%溴菌腈对降香黄檀炭疽病菌的抑制作用最强，其EC50值为0.019 5 mg/mL；97%吡唑醚菌酯次之，EC50值为0.025 6 mg/mL；81%氨基寡糖素对降香黄檀炭疽病菌抑制作用最差，EC50值>5 mg/mL。
2.2 对油茶炭疽菌菌丝的室内毒力测定
不同供试药剂对降香黄檀炭疽病菌的抑制效果见图2、表2。可以看出，98%溴菌腈对油茶炭疽病菌的抑制作用最强，其EC50值为0.001 1 mg/mL；96.8%苯醚甲環唑和97%吡唑醚菌酯次之，EC50值分别为0.004 2 mg/mL和0.004 3 mg/mL；81%氨基寡糖素对降香黄檀炭疽病菌抑制作用最差，EC50值>5 mg/mL。
3 结论与讨论
试验结果表明，7种供试杀菌剂中，除81%氨基寡糖素外，其他6种供试杀菌剂对降香黄檀和油茶炭疽病菌的生长均有抑制作用，但抑菌效果均不如阳性对照80%多菌灵。7种供试杀菌剂对降香黄檀和油茶炭疽病菌的抑制作用具有相似性，其中抑制作用最强的均是98%溴菌腈，EC50值分别为0.019 5 mg/mL和0.001 1 mg/mL；其次是97%吡唑醚菌酯和96.8%苯醚甲环唑，而81%氨基寡糖素对2种炭疽病菌几乎无抑制作用。
目前，对于炭疽菌属真菌的研究报道较多[17]，但是不同杀菌剂对降香黄檀和油茶炭疽病菌的室内毒力测定研究还较少。本研究结果表明，溴菌腈、苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯等供试药剂具有极强的抑菌效果，这与杨成德等[18]、韦文添[19]对其他种炭疽菌的研究结果类似。溴菌腈又名炭特灵，能抑制和铲除细菌、真菌及藻类的生长，在国内主要应用于农作物病害的防治和鱼塘灭藻及工业废水处理，是目前国内杀菌剂中防治各类作物炭疽病的特效药剂[20]。而苯醚甲环唑又称噁醚唑，为三唑类杀菌剂，通过抑制真菌和细菌的细胞麦角甾醇（是构成细胞膜的重要成分，对细胞膜的理化性质渗透性起重要作用）的生物合成，破坏细胞膜结构与功能，从而达到杀菌目的[21]。炭疽病的防治是一项系统工程，应贯彻“防重于治”的方针，以营林措施为基础，辅之以化学防治，采用综合治理的方针。合理使用杀菌剂只是其中的一种手段，本文的研究结果为以后降香黄檀和油茶炭疽病的防治提供了重要的理论依据。
4 参考文献
[1] 黄培忠，卢立华.珍贵树种降香黄檀[J].广西林业，2004（6）：39.
[2] 姜爱莉，孙利芹.降香抗氧化成分的提取及活性研究[J].精细化工，2004，21（7）：525-528.
[3] 刘荣霞，王巧，毕开顺，等.降香药材色谱指纹图谱的建立及其在药材鉴定中的应用[J].药学学报，2005（11）：48-52.
[4] KANG T H，TIAN Y H，KIM Y C.Isoliquiritigenin：A Competitive 1 Ros-inase Inhibitor from the Heartwood of Dalbergia odorifera[J].Journal of Applied Pharmacology，2005，13（1）：32-34.
[5] 周洁尘，刘君昂，何苑皞，等.13种海南入侵植物提取物对降香黄檀炭疽病菌的抑制作用[J].植物保护，2015，41（5）：54-60.
[6] 陈永忠，王德斌.湖南省油茶良种选育及推广应用概况[J].湖南林业科技，2001，28（3）：25-29.
[7] 邓鑫州，黄连桂，邓荫伟.5 种药剂对油茶炭疽病的防治效果研究[J].安徽农业科学，2011，39（16）：9653-9654.
[8] 徐学兵.茶油研究进展述评[J].中国油脂，1995，20（5）：7-9.
[9] SUN F F，TANG S，LIU R，et al.Biorefining Fractionation of the Camellia oleifera Abel.hull into Diverse Bioproducts with a Two-Stage Organosolv Extraction[J].Industrial Crops and Products，2016，94：790-799.
[10] 韩长志.炭疽菌属真菌分类研究现状及发展趋势[J].中国植保导刊，2015，35（6）：24-30.
[11] CANNON P F，BUDDIE A G.The Typification of Colletotrichum gloeos-porioides[J].Mycotaxon，2008，104：189-204.
[12] 李石磊，刘君昂，赵莹，等.6 种杀菌剂对油茶主要病害的室内毒力测定[J].中南林业科技大学学报，2013，33（9）：60-62.
[13] 桑利伟，刘爱勤， 孙世伟，等.海南降香黄檀炭疽病病原鉴定及防治[J].热带农业科学，2009，29（8）：23-25.
[14] 靳爱仙，周国英，李河.油茶炭疽病的研究现状、问题与方向[J].中国森林病虫，2009，28（2）：27-31.
[15] K？魻LLER W，WILCOX W F，PARKER D M.Sensitivity of Venturia Ina-equalis Populations to Anilinopyrimidine Fungicides and Their Contr-ibution to Scab Management in New York[J].Plant Disease，2005，89：357-365.
[16] 孟昭礼，罗兰，袁中林.人工模拟的植物源杀菌剂银泰防治番茄3 种病害效果研究[J].中国农业科学，2002，35（7）：863-866.
[17] 刘伟.油茶炭疽病的病原学、发病规律及防治技术研究[D].武汉：华中农业大学，2012.
[18] 杨成德，姜红霞.甘肃省马铃薯炭疽病的鉴定及室内药剂筛选[J].植物保护，2012，38（6）：127-133.
[19] 韦文添.不同杀菌剂对辣椒炭疽病菌的室内毒力测定[J].江苏农业科学，2013，41（4）：117-119.
[20] 刘伟.溴菌腈在苹果和土壤中的残留消解动态研究[J].农业环境科学学报，2008，27（2）：792-794.
[21] 华乃震.杀菌剂苯醚甲环唑的进展和应用[J].世界农药，2013，35（6）：7-6.