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【中图分类号】R392.7【文献标识码】B【文章编号】1632-5281（2015）10
【摘要】目的：探究生物反应器制备Vero细胞人用狂犬疫苗。方法：将aGV设置为毒种，而培养基采用Vero细胞，通过14L生物反应器对其进行培养，培养方法则为灌流式，随后将收集到的病毒也通过相关方法进行纯化后，并将冻干保护剂放置在其中，制备狂犬疫苗，对冻干前后和37℃的疫苗效果进行评价。结果：通过对其的评价，细胞密度每毫升为1.0×107个，病毒收获液毒力大于7.5LgLD50，经纯化之后的蛋白质含量每剂在80μg之下，Vero细胞DNA残留量在100pg之下，疫苗效价每剂在4.0IU以上。结论：应用生物反应器制备有助于人用狂犬疫苗的制备。
【关键词】生物反应器；Vero细胞；人用狂犬病疫苗
就目前而言，我国采用的狂犬病疫苗制备有的为原代地鼠肾细胞，培养方式采用转瓶来进行，而生物反应器制备人用狂犬疫苗的工艺也逐渐成熟起来[1]。此研究则通过生物反应器制备人用狂犬病疫苗（Vero细胞），现将制备结果作如下报道：
1 资料与方法
1.1 一般资料
美国ATCC提供Vero细胞，而武汉生物制品研究所所捐赠的为BSR细胞，而采用aGV疫苗作为狂犬病毒疫苗，此疫苗由本科室予以保管，同时从中国药品生物制品检定所购买CVS-11。
1.2 方法
1.2.1 试剂以及仪器
从美国公司购买片状载体，小牛血清则为武汉三利益生物公司所生产，β-丙内酯则为日本所产生，选择美国NBS公司所生产的生物反应器，选择YSI公司所生产的生化分析仪。
1.2.2 制备
选择转瓶方法对毒种进行培养。将病毒接种在Vero细胞中，并在37℃的环境下进行培养，培养时间为48h，同时将维持液进行更换，并放置在33℃的环境中进行72h培养，随后对病毒液进行收集。进行病毒滴度检测，合格后放置在-70℃冰箱中进行储存。
1.2.3 Vero细胞的培养
细胞复苏：取待传代的Vero细胞进行复苏，扩增培养，直至所需要的数量及代次。然后将3L瓶中的Vero细胞消化后转移至反应器内进行培养。当细胞达到一定密度时按0.1～0.01MOI接种病毒。
接种病毒之后将其放置在37℃的环境下进行培养，培养时间为2小时[2]。将其放置在33℃的灌流中进行培养，随后其葡萄糖的浓度每升应>0.5g。在病毒接种后的48小时对病毒液进行收集，每间隔12小时对其进行一次取样进行病毒滴度检测。
1.2.4 制备疫苗原液
病毒灭活：在病毒收获液中加入β-丙内酯，放置在4℃的环境进行灭活，时间为20小时，随后在37℃的水中进行水解2小时，将β-丙内酯进行去除，各项指标检测合格之后经过30万分子量的膜包进行超滤、浓缩，后经过sepharose4FF色谱法进行纯化获取抗原峰，加入人血白蛋白及冻干保护剂，制成疫苗原液。
1.2.5 疫苗成品
当对疫苗原液进行检测合格之后，将其进行分装，冻干。对疫苗冻干前后的效价进行评估，同时将3批疫苗放置在37℃的环境下，放置时间为28天[3]。
2 结果
三批疫苗冻干前的效价分别为5.94IU、5.36 IU以及5.09IU，冻干后的效价分别为5.54IU、5.047IU以及4.6IU，经比较冻干疫苗与液体疫苗效价相比下降小于0.5IU/剂。冻干后的效价分别为5.54IU、5.047IU以及4.6IU，热稳后疫苗效力为4.9IU、4.47IU以及3.96IU，热稳定试验后疫苗与对照疫苗相比效价下降小于0.8IU/剂.
通过检查之后，三批疫苗原液的检测结果中蛋白质含量分别为78μg/剂、74μg/剂以及68μg/剂，Vero细胞蛋白质残留量则分别为3.5μg/剂、2.7μg/剂以及2.2μg/剂；Vero细胞DNA残留量均在100pg/剂以下。
3 讨论
Vero细胞能够选择转瓶、微载体方法以及生物反应器方法进行培养，生物反应器能够有效的提升细胞的密度，通常情况下，利用微载体对细胞进行培养能够提升其倍数[4]。
毒种则是疫苗中的主要内容，此研究采用转瓶方法对毒种进行培养，良好的获取时间则为6天[5]。而细胞在培养的7-9天时会出现脱落现象，从而对病毒的获取造成一定的影响，所以在进行接种细胞的过程中应将范围进行确定。该方法可以按照葡萄糖的消耗数量来对细胞数进行估算。
综上所述，此研究中所制备的冻干人用狂犬疫苗通过检测后，均符合《中国药典》中的相关规定。此工艺技术有助于狂犬病疫苗的制备，是良好的发展方向。
参考文献：
[1] 杨屹，汝东宇，郭秀侠等.应用篮式生物反应器制备Vero细胞人用狂犬病疫苗[J].中国生物制品学杂志，2011，24（5）：583-585，589.
[2] 刘杰，刘辉，杨会强等.冻干人用狂犬病疫苗中Vero细胞残留DNA去除方法的研究[A].//2013中国生物制品年会暨第十三次全国生物制品学术研讨会论文集[C].2013：14-17.
[3] 苗丽，丁丽丽，李春艳等.食蟹猴肌肉注射冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）的长期毒性[J].中国生物制品学杂志，2014，27（11）：1369-1374.
[4] 刘杰，刘辉，杨会强等.多种方法结合去除冻干人用狂犬病疫苗中Vero细胞残留DNA[J].中国生物制品学杂志，2013，26（12）：1827-1830.
[5] 吴金妍，王琰，储艳等.国产冻干人用狂犬病纯化疫苗（Vero细胞微载体）的接种反应和免疫原性[J].中国生物制品学杂志，2014，27（12）：1574-1578.
【摘要】目的：探究生物反应器制备Vero细胞人用狂犬疫苗。方法：将aGV设置为毒种，而培养基采用Vero细胞，通过14L生物反应器对其进行培养，培养方法则为灌流式，随后将收集到的病毒也通过相关方法进行纯化后，并将冻干保护剂放置在其中，制备狂犬疫苗，对冻干前后和37℃的疫苗效果进行评价。结果：通过对其的评价，细胞密度每毫升为1.0×107个，病毒收获液毒力大于7.5LgLD50，经纯化之后的蛋白质含量每剂在80μg之下，Vero细胞DNA残留量在100pg之下，疫苗效价每剂在4.0IU以上。结论：应用生物反应器制备有助于人用狂犬疫苗的制备。
【关键词】生物反应器；Vero细胞；人用狂犬病疫苗
就目前而言，我国采用的狂犬病疫苗制备有的为原代地鼠肾细胞，培养方式采用转瓶来进行，而生物反应器制备人用狂犬疫苗的工艺也逐渐成熟起来[1]。此研究则通过生物反应器制备人用狂犬病疫苗（Vero细胞），现将制备结果作如下报道：
1 资料与方法
1.1 一般资料
美国ATCC提供Vero细胞，而武汉生物制品研究所所捐赠的为BSR细胞，而采用aGV疫苗作为狂犬病毒疫苗，此疫苗由本科室予以保管，同时从中国药品生物制品检定所购买CVS-11。
1.2 方法
1.2.1 试剂以及仪器
从美国公司购买片状载体，小牛血清则为武汉三利益生物公司所生产，β-丙内酯则为日本所产生，选择美国NBS公司所生产的生物反应器，选择YSI公司所生产的生化分析仪。
1.2.2 制备
选择转瓶方法对毒种进行培养。将病毒接种在Vero细胞中，并在37℃的环境下进行培养，培养时间为48h，同时将维持液进行更换，并放置在33℃的环境中进行72h培养，随后对病毒液进行收集。进行病毒滴度检测，合格后放置在-70℃冰箱中进行储存。
1.2.3 Vero细胞的培养
细胞复苏：取待传代的Vero细胞进行复苏，扩增培养，直至所需要的数量及代次。然后将3L瓶中的Vero细胞消化后转移至反应器内进行培养。当细胞达到一定密度时按0.1～0.01MOI接种病毒。
接种病毒之后将其放置在37℃的环境下进行培养，培养时间为2小时[2]。将其放置在33℃的灌流中进行培养，随后其葡萄糖的浓度每升应>0.5g。在病毒接种后的48小时对病毒液进行收集，每间隔12小时对其进行一次取样进行病毒滴度检测。
1.2.4 制备疫苗原液
病毒灭活：在病毒收获液中加入β-丙内酯，放置在4℃的环境进行灭活，时间为20小时，随后在37℃的水中进行水解2小时，将β-丙内酯进行去除，各项指标检测合格之后经过30万分子量的膜包进行超滤、浓缩，后经过sepharose4FF色谱法进行纯化获取抗原峰，加入人血白蛋白及冻干保护剂，制成疫苗原液。
1.2.5 疫苗成品
当对疫苗原液进行检测合格之后，将其进行分装，冻干。对疫苗冻干前后的效价进行评估，同时将3批疫苗放置在37℃的环境下，放置时间为28天[3]。
2 结果
三批疫苗冻干前的效价分别为5.94IU、5.36 IU以及5.09IU，冻干后的效价分别为5.54IU、5.047IU以及4.6IU，经比较冻干疫苗与液体疫苗效价相比下降小于0.5IU/剂。冻干后的效价分别为5.54IU、5.047IU以及4.6IU，热稳后疫苗效力为4.9IU、4.47IU以及3.96IU，热稳定试验后疫苗与对照疫苗相比效价下降小于0.8IU/剂.
通过检查之后，三批疫苗原液的检测结果中蛋白质含量分别为78μg/剂、74μg/剂以及68μg/剂，Vero细胞蛋白质残留量则分别为3.5μg/剂、2.7μg/剂以及2.2μg/剂；Vero细胞DNA残留量均在100pg/剂以下。
3 讨论
Vero细胞能够选择转瓶、微载体方法以及生物反应器方法进行培养，生物反应器能够有效的提升细胞的密度，通常情况下，利用微载体对细胞进行培养能够提升其倍数[4]。
毒种则是疫苗中的主要内容，此研究采用转瓶方法对毒种进行培养，良好的获取时间则为6天[5]。而细胞在培养的7-9天时会出现脱落现象，从而对病毒的获取造成一定的影响，所以在进行接种细胞的过程中应将范围进行确定。该方法可以按照葡萄糖的消耗数量来对细胞数进行估算。
综上所述，此研究中所制备的冻干人用狂犬疫苗通过检测后，均符合《中国药典》中的相关规定。此工艺技术有助于狂犬病疫苗的制备，是良好的发展方向。
参考文献：
[1] 杨屹，汝东宇，郭秀侠等.应用篮式生物反应器制备Vero细胞人用狂犬病疫苗[J].中国生物制品学杂志，2011，24（5）：583-585，589.
[2] 刘杰，刘辉，杨会强等.冻干人用狂犬病疫苗中Vero细胞残留DNA去除方法的研究[A].//2013中国生物制品年会暨第十三次全国生物制品学术研讨会论文集[C].2013：14-17.
[3] 苗丽，丁丽丽，李春艳等.食蟹猴肌肉注射冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）的长期毒性[J].中国生物制品学杂志，2014，27（11）：1369-1374.
[4] 刘杰，刘辉，杨会强等.多种方法结合去除冻干人用狂犬病疫苗中Vero细胞残留DNA[J].中国生物制品学杂志，2013，26（12）：1827-1830.
[5] 吴金妍，王琰，储艳等.国产冻干人用狂犬病纯化疫苗（Vero细胞微载体）的接种反应和免疫原性[J].中国生物制品学杂志，2014，27（12）：1574-1578.