【摘 要】
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目的 探讨生物钟基因(MCLK)1对HT22细胞凋亡及磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响.方法 构建靶向MCLK1-shRNA的慢病毒载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒.MCLK1慢病毒转染HT22细胞(Lv-MCLK1组),降低MCLK1蛋白表达,设立空载作为对照(Lv-NC组).TUNEL技术对HT22细胞凋亡进行形态学观察.Western印迹检测各组细胞中MCLK1、低氧诱导因子(HIF)-1、PI3K、Akt、磷酸化(p)-Akt及凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤(
【机 构】
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河北北方学院神经药理学重点实验室,河北 张家口 075000;河北北方学院附属第一医院,河北 张家口 075000
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目的 探讨生物钟基因(MCLK)1对HT22细胞凋亡及磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响.方法 构建靶向MCLK1-shRNA的慢病毒载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒.MCLK1慢病毒转染HT22细胞(Lv-MCLK1组),降低MCLK1蛋白表达,设立空载作为对照(Lv-NC组).TUNEL技术对HT22细胞凋亡进行形态学观察.Western印迹检测各组细胞中MCLK1、低氧诱导因子(HIF)-1、PI3K、Akt、磷酸化(p)-Akt及凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)-3、酶切(cleaved)-Caspase-3的表达.实时荧光定量PCR技术检测各组细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达水平的变化.结果 TUNEL结果显示,Lv-MCLK1组HT22细胞凋亡率与Lv-NC组相比明显降低(P<0.01).MCLK1慢病毒转染能明显降低HT22细胞中MCLK1蛋白表达(P<0.01).与Lv-NC组相比,Lv-MCLK1组中HIF-1、p-Akt、抗凋亡蛋白Bcl-2水平显著升高(P0.05),PI3K蛋白水平上调(P<0.05),Bax/Bcl-2比值下降(P<0.01),Caspase-3、cleaved-Caspase-3明显下调(P<0.01).实时荧光定量PCR显示,Lv-MCLK1组中Bcl-2(P<0.05)、Bax mRNA水平上调(P0.05),Caspase-3的mRNA水平显著下调(P<0.01).结论 抑制HT22细胞中MCLK1表达可以抑制细胞凋亡,其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路进而影响凋亡相关蛋白的产生有关.
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