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【摘要】 目的 建立小鼠心肌細胞缺氧/复氧模型,观察α-1抗胰蛋白酶(α-1 antitrypsin,A1AT)对小鼠心肌细胞凋亡的影响。
方法 体外采用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)4 mmol/L诱导的缺氧培养基培养小鼠心肌细胞,模拟缺氧/复氧模型,并筛选A1AT最佳干预浓度,筛选A1AT最佳干预浓度实验分为7个组:Blank组、Control组、H/R组、A1AT 10 μmol/L 组、A1AT 20 μmol/L 组、A1AT 40 μmol/L 组以及A1AT 80 μmol/L 组。筛选最佳干预时间实验分为8个组:Blank组、Control组、H/R组、A1AT 1 h组、A1AT 2 h组、A1AT 4 h组、A1AT 6 h组及A1AT 12 h组。之后A1AT干预实验分组:正常组(Control组)、缺氧/复氧组(H/R组)、α-1抗胰蛋白酶干预组(A1AT组)。利用CCK-8检测细胞功能、流式细胞仪检测细胞凋亡、免疫荧光及Western Blot 检测caspase-3的表达。并用SPSS 22.0进行数据统计。
结果 A1AT最佳干预浓度为20 μmol/L,最佳干预时间为4小时。流式细胞仪检测发现H/R组细胞凋亡率增加,A1AT组细胞凋亡率明显下降,Control组、H/R组及A1AT组三组比较差异有统计学意义( P <0.05)。免疫荧光检测发现H/R组caspase-3分子表达强阳性,与Control组及A1AT组比较,差异有统计学意义( P <0.05)。Western Blot检测发现H/R组caspase-3蛋白表达上调,与Control组及A1AT组比较,差异有统计学意义( P <0.05)。
结论 α-1抗胰蛋白酶对小鼠缺氧/复氧心肌细胞凋亡具有改善作用。
【关键词】 α-1抗胰蛋白酶;Na2S2O4;缺氧/复氧;凋亡;caspase-3
中图分类号: R363 文献标志码: A DOI: 10.3969/j.issn.1003-1383.2021.08.003
Effects of α-1 antitrypsin on cardiomyocyte apoptosis in hypoxia/reoxygenation mice
HUANG Da, LIU Yan, HUANG Lansong, CEN Tuan, LIU Wenjing, PAN Xingshou, HUANG Zhaohe▲
(Department of Cardiovascular, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, Baise 533000, Guangxi, China)
【Abstract】 Objective To establish a hypoxia/reoxygenation model of cardiomyocytes in mice, and observe the effect of α-1 antitrypsin (A1AT) on cardiomyocyte apoptosis in mice.
Methods Mouse cardiomyocytes were cultured in vitro by hypoxia medium induced by (Na2S2O4) 4 mmol/L of sodium dithionite, hypoxia/reoxygenation model was simulated, and the best intervention concentration of A1AT was selected. The experiment of screening the best intervention concentration of A1AT was divided into 7 groups: blank group, control group, H/R group and A1AT 10 μmol/L group, A1AT 20 μmol/L group, A1AT 40 μmol/L group and A1AT 80 μmol/L group. The experiment of screening the best intervention time was divided into 8 groups: blank group, control group, H/R group, A1AT 1 h group, A1AT 2 h group, A1AT 4 h group, A1AT 6 h group and A1AT 12 h group. After that, A1AT intervention experiment was divided into normal group (control group), hypoxia reoxygenation group (H/R group) and α-1 antitrypsin intervention group (A1AT group). CCK-8 was used to detect cell function, flow cytometry was used to detect the expression of apoptosis, and immunofluorescence and Western Blot were used to detect the expression of caspase-3. In addition, SPSS 22.0 was used for data statistics. Results The best intervention concentration for A1AT was 20 μmol/L, and the best intervention time was 4 hours. The results of flow cytometry showed that the apoptosis rate increased in the H/R group and decreased significantly in the A1AT group, and there was statistically significant difference among the control group, the H/R group and the A1AT group ( P < 0.05). The Immunofluorescence detection revealed that the expression of caspase-3 molecules in the H/R group was strong positive, and compared with the control group and the A1AT group, the difference was statistically significant ( P < 0.05). Western Blot detection revealed that the expression of caspase-3 molecules in the H/R group was up-regulated, and compared with the control group and the A1AT group, the difference was statistically significant ( P < 0.05).
Conclusion α-1 antitrypsin can improve the apoptosis of hypoxia/reoxygenation cardiomyocytes in mice.
【Key words】 A1AT; Na2S2O4; hypoxia/reoxygenation; apoptosis; caspase-3
目前,心血管病死亡占城鄉居民总死亡原因的首位,农村占45.91%,城市占43.56%[1]。《中国心血管健康与疾病报告2019》推算心血管病现患人数3.30亿,其中冠心病1100万,肺源性心脏病500万,心力衰竭890万,先天性心脏病200万,高血压2.45亿。心血管病死亡率的上升趋势主要是由于缺血性心脏病(ischemia heart disease,IHD)死亡上升所致。急性心肌梗死是IHD的主要类型,早期再灌注治疗是恢复心肌血液供应唯一有效的途径,虽然及时恢复心肌血液灌注挽救了不少生命,但心脏血液供应不足一段时间后,恢复血液灌注心肌损伤反而加重,从而出现心肌顿抑、心脏功能下降甚至致命性心律失常,即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemic reperfusion injury,MIRI)。再灌注后心肌坏死面积增加50%[2]。但MIRI的发生机制尚未完全明了,可能与氧自由基、炎性细胞因子、蛋白酶等介导的内皮细胞功能受损及心肌受损有关[3~4]。其中,凋亡在MIRI中起到很关键的作用。然而,迄今为止,尚未发现任何一种有效防止MIRI的方法。α-1抗胰蛋白酶(α-1 antitrypsin,A1AT)是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的一员,其主要作用是保护机体正常细胞和器官不受蛋白酶的损伤,抑制感染和炎症,维持机体内环境的平衡[5]。近年来,A1AT在干预炎症因子的治疗研究中愈来愈得到广大学者的青睐,目前已经广泛用于各种炎症疾病的治疗。本实验研究是在心肌缺血再灌注损伤学说的基础上,总结前人经验,建立小鼠心肌细胞缺氧/复氧模型,探索A1AT对小鼠缺氧/复氧心肌细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
导师组冻存小鼠心肌细胞(型号FMC84,来源:ATCC),caspase-3抗体购自CST。
1.2 检测方法
1.2.1 CCK-8检测法筛选A1AT最佳干预浓度及最佳干预时间
筛选A1AT最佳干预浓度实验分为 7个组:Blank组、Control组、H/R组、A1AT 10 μmol/L 组、A1AT 20 μmol/L 组、A1AT 40 μmol/L 组以及A1AT 80 μmol/L 组,按设定的浓度预先干预2小时,孔中换成4 mmol/L的Na2S2O4诱导缺氧1小时后,吸取Na2S2O4溶液弃掉,并予PBS清洗两次,予含有10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L及80 μmol/L的α-1抗胰蛋白酶的完全培养基复氧24小时,用CCK8检测它们的活力,筛选最佳α-1抗胰蛋白酶干预浓度。筛查A1AT最佳干预时间实验分为8个组:Blank组、Control组、H/R组、A1AT 1 h组、A1AT 2 h组、A1AT 4 h组、A1AT 6 h组及A1AT 12 h组,心肌细胞接种至96孔板中,以α-1抗胰蛋白酶最佳干预浓度干预,待细胞贴壁后,予20 μmol/L α-1抗胰蛋白酶分别干预1 h、2 h、4 h、6 h和12 h,到时间即去掉α-1抗胰蛋白酶药液,并予PBS清洗两次,予4 mmol/L Na2S2O4干预60 min建立小鼠心肌细胞缺氧模型,之后去掉Na2S2O4溶液,予完全培养基复氧24小时,进行CCK8检测。 1.2.2 利用流式细胞仪双染法检测细胞凋亡
我们利用流式细胞仪检测细胞凋亡,采用AnnexinV-FITC/PI双染法标记小鼠心肌细胞FMC84,对Control组、H/R组、A1AT组进行凋亡检测,收集细胞后在1小时内完成上机检测。设置四个象限,分别为1象限:此区域为机械损伤及坏死细胞;2象限:此区域为晚期凋亡细胞;3象限:此区域为存活细胞;4象限:其区域为早期凋亡细胞。以4象限细胞数来判定各组细胞早期凋亡程度。
1.2.3 利用免疫荧光检测caspase-3表达
按一定细胞浓度在24孔板种植细胞,待细胞爬片后以4%的聚甲醛固定,0.5% Triton 破膜,山羊血清封闭,之后以一抗4℃ 孵育过夜,加荧光二抗,滴加DAPI再染核,在荧光显微镜下观察采集图像。
1.2.4 Western Blot检测caspase-3表达
按一定的细胞浓度在6孔板中种植细胞,待细胞贴壁后进行造模及药物干预,收取细胞,提取蛋白,按提取的蛋白浓度在电泳槽中上样,跑电泳,转膜,一抗孵育过夜,孵育二抗,利用凝胶系统成像仪进行显影。
1.3 统计学方法
用Graphprism 5.0进行作图。应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析,计量资料符合正态分布,以均数±标准差( ±s )表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用 q 检验(Newman-Keuls法),检验水准:α=0.05,双侧检验。
2 结 果
2.1 A1AT干预心肌细胞缺氧/复氧的浓度梯度探索
与Blank组比较,不同浓度的A1AT均可不同程度地影响小鼠心肌细胞活力,其中A1AT 20 μmol/L 组的影响最明显。提示α-1抗胰蛋白酶20 μmol/L是最佳干预浓度。见表1。
2.2 A1AT干预心肌细胞缺氧/复氧的时间梯度探索
与Control组相比,α-1抗胰蛋白酶作用时间不同可对细胞活力造成不同的影响,其中A1AT 4 h组作用时间最佳,4小时后随着α-1抗胰蛋白酶作用时间越长,细胞活力逐渐下降。α-1抗胰蛋白酶4小时作用的OD值与对照组及A1AT 2 h组比较无统计学意义,但与其他作用时间组及H/R组比较差异均有统计学意义( P <0.05)。提示α-1抗胰蛋白酶干预的最佳时间为4小时。见表2。
2.3 流式细胞仪检测小鼠心肌细胞凋亡
与Control组比较,H/R组心肌细胞早期凋亡明显增加,A1AT干预后心肌细胞凋亡减少,差异有统计学意义( P <0.05)。结果提示Na2S2O4诱导的心肌细胞缺氧/复氧可以增加心肌细胞凋亡,A1AT预先干预后Na2S2O4诱导的心肌细胞缺氧/复氧心肌细胞早期凋亡减少(图1)。
2.4 免疫荧光检测小鼠心肌细胞caspase-3分子表达
caspase-3免疫荧光阳性为小鼠心肌细胞核呈现蓝色荧光物质。Control组、H/R组、A1AT组caspase-3的平均阳性表达率分别为19.16%,68.47%,35.52%,染色强度为弱阳性、强阳性、弱阳性,平均总积分分别为1分,5分,2.67分。Control组染色为阴性,H/R组及A1AT染色为阳性,且H/R组较A1AT组更为明显(图2),三组比较差异有统计学意义( P <0.05)。提示A1AT对MIRI细胞凋亡有保护作用。
2.5 Western Blot 检测小鼠心肌细胞 caspase-3蛋白表达
我们利用Western Blot 技术对caspase-3蛋白的表达水平进行检测,结果发现:与Control组比较,H/R组caspase-3表达明显上调,A1AT干预后其表达明显下调,三组比较差异有统计学意义( P <005)(图3)。说明A1AT对MIRI心肌细胞凋亡具有保护作用。
3 讨 论
MIRI后坏死心肌的面积增加了50%[2],但发生机制尚未完全明了,可能与氧化应激、炎症因子等介导的细胞凋亡有关[3~4]。由于MIRI預后差,危害大,对MIRI的治疗也成为当前医疗界的研究热点之一。
A1AT是急性反应性蛋白质,在炎症性疾患时,A1AT可透过毛细血管进入组织液,在炎症局部往往浓度很高,对急性炎性疾病有一定限制作用[6]。A1AT具有免疫调节、抗炎和细胞保护特性,与降低IL-6和IL-8的表达和成熟有关[7]。冠状动脉硬化症的发生与炎症因子密切相关,国外研究发现,血浆A1AT水平与心绞痛患者冠状动脉狭窄的存在和严重程度相关[8],还有研究发现,A1AT可以抑制IL-1的产生从而影响急性冠脉综合征的预后[9]。A1AT在干预炎症因子的治疗中愈来愈得到广大学者的青睐,目前已经广泛用于各种炎症疾病。因此,干预炎症因子对防治MIRI尤为重要。
缺血性心肌病大多数是由急性冠脉综合征演变而来,且其发生机制与氧自由基、炎症因子有关[10]。氧化应激是炎症的特征之一, 氧化应激不仅可以导致组织损伤, 还可以促进炎症反应[11]。氧化应激是炎症反应的特征表现之一,氧化应激导致的炎症反应在缺血再灌注损伤发生时爆发[12~13]。因此,阻断炎症反应及氧化应激可以在一定程度上减轻缺血再灌注损伤。炎症细胞因子的代表性家族为白介素家族,处于免疫反应及凋亡的上游,可以调控凋亡的发生,从而加剧缺血再灌注损伤[14]。我们的研究发现,心肌细胞缺氧/复氧后,细胞凋亡发生率明显减少,caspase-3表达明显增加,提示凋亡参与心肌缺血再灌注损伤的发生发展,这与王娓娓团队及李奇的研究一致[15~16]。近年来,随着临床药物的深入研究与应用发现,A1AT在控制炎症和免疫过程中起关键作用[17~18],我们的研究亦发现,心肌细胞缺氧/复氧予A1AT干预后,心肌细胞凋亡发生率明显下降,且caspase-3表达明显下降,这可能与A1AT可以有效干预炎症反应[19]进而抑制细胞凋亡有关。说明A1AT具有干预凋亡的作用,但目前这方面的研究甚少。但有国外报道A1AT可减少缺血再灌注引起的急性炎症损伤[20],有学者使用内皮细胞单层暴露于缺氧/复氧模型来研究A1AT在人脐静脉内皮细胞中的作用,结果发现 A1AT的过表达可抗氧化应激从而降低了细胞凋亡并促进了增殖[21]。 综上所述,凋亡是MIRI的关键环节,A1AT可以下调caspase-3,A1AT可能通过干预凋亡起到预防心肌缺血再灌注损伤的作用。
参 考 文 献
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(收稿日期:2021-04-13 修回日期:2021-07-23)
(編辑:梁明佩)
方法 体外采用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)4 mmol/L诱导的缺氧培养基培养小鼠心肌细胞,模拟缺氧/复氧模型,并筛选A1AT最佳干预浓度,筛选A1AT最佳干预浓度实验分为7个组:Blank组、Control组、H/R组、A1AT 10 μmol/L 组、A1AT 20 μmol/L 组、A1AT 40 μmol/L 组以及A1AT 80 μmol/L 组。筛选最佳干预时间实验分为8个组:Blank组、Control组、H/R组、A1AT 1 h组、A1AT 2 h组、A1AT 4 h组、A1AT 6 h组及A1AT 12 h组。之后A1AT干预实验分组:正常组(Control组)、缺氧/复氧组(H/R组)、α-1抗胰蛋白酶干预组(A1AT组)。利用CCK-8检测细胞功能、流式细胞仪检测细胞凋亡、免疫荧光及Western Blot 检测caspase-3的表达。并用SPSS 22.0进行数据统计。
结果 A1AT最佳干预浓度为20 μmol/L,最佳干预时间为4小时。流式细胞仪检测发现H/R组细胞凋亡率增加,A1AT组细胞凋亡率明显下降,Control组、H/R组及A1AT组三组比较差异有统计学意义( P <0.05)。免疫荧光检测发现H/R组caspase-3分子表达强阳性,与Control组及A1AT组比较,差异有统计学意义( P <0.05)。Western Blot检测发现H/R组caspase-3蛋白表达上调,与Control组及A1AT组比较,差异有统计学意义( P <0.05)。
结论 α-1抗胰蛋白酶对小鼠缺氧/复氧心肌细胞凋亡具有改善作用。
【关键词】 α-1抗胰蛋白酶;Na2S2O4;缺氧/复氧;凋亡;caspase-3
中图分类号: R363 文献标志码: A DOI: 10.3969/j.issn.1003-1383.2021.08.003
Effects of α-1 antitrypsin on cardiomyocyte apoptosis in hypoxia/reoxygenation mice
HUANG Da, LIU Yan, HUANG Lansong, CEN Tuan, LIU Wenjing, PAN Xingshou, HUANG Zhaohe▲
(Department of Cardiovascular, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, Baise 533000, Guangxi, China)
【Abstract】 Objective To establish a hypoxia/reoxygenation model of cardiomyocytes in mice, and observe the effect of α-1 antitrypsin (A1AT) on cardiomyocyte apoptosis in mice.
Methods Mouse cardiomyocytes were cultured in vitro by hypoxia medium induced by (Na2S2O4) 4 mmol/L of sodium dithionite, hypoxia/reoxygenation model was simulated, and the best intervention concentration of A1AT was selected. The experiment of screening the best intervention concentration of A1AT was divided into 7 groups: blank group, control group, H/R group and A1AT 10 μmol/L group, A1AT 20 μmol/L group, A1AT 40 μmol/L group and A1AT 80 μmol/L group. The experiment of screening the best intervention time was divided into 8 groups: blank group, control group, H/R group, A1AT 1 h group, A1AT 2 h group, A1AT 4 h group, A1AT 6 h group and A1AT 12 h group. After that, A1AT intervention experiment was divided into normal group (control group), hypoxia reoxygenation group (H/R group) and α-1 antitrypsin intervention group (A1AT group). CCK-8 was used to detect cell function, flow cytometry was used to detect the expression of apoptosis, and immunofluorescence and Western Blot were used to detect the expression of caspase-3. In addition, SPSS 22.0 was used for data statistics. Results The best intervention concentration for A1AT was 20 μmol/L, and the best intervention time was 4 hours. The results of flow cytometry showed that the apoptosis rate increased in the H/R group and decreased significantly in the A1AT group, and there was statistically significant difference among the control group, the H/R group and the A1AT group ( P < 0.05). The Immunofluorescence detection revealed that the expression of caspase-3 molecules in the H/R group was strong positive, and compared with the control group and the A1AT group, the difference was statistically significant ( P < 0.05). Western Blot detection revealed that the expression of caspase-3 molecules in the H/R group was up-regulated, and compared with the control group and the A1AT group, the difference was statistically significant ( P < 0.05).
Conclusion α-1 antitrypsin can improve the apoptosis of hypoxia/reoxygenation cardiomyocytes in mice.
【Key words】 A1AT; Na2S2O4; hypoxia/reoxygenation; apoptosis; caspase-3
目前,心血管病死亡占城鄉居民总死亡原因的首位,农村占45.91%,城市占43.56%[1]。《中国心血管健康与疾病报告2019》推算心血管病现患人数3.30亿,其中冠心病1100万,肺源性心脏病500万,心力衰竭890万,先天性心脏病200万,高血压2.45亿。心血管病死亡率的上升趋势主要是由于缺血性心脏病(ischemia heart disease,IHD)死亡上升所致。急性心肌梗死是IHD的主要类型,早期再灌注治疗是恢复心肌血液供应唯一有效的途径,虽然及时恢复心肌血液灌注挽救了不少生命,但心脏血液供应不足一段时间后,恢复血液灌注心肌损伤反而加重,从而出现心肌顿抑、心脏功能下降甚至致命性心律失常,即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemic reperfusion injury,MIRI)。再灌注后心肌坏死面积增加50%[2]。但MIRI的发生机制尚未完全明了,可能与氧自由基、炎性细胞因子、蛋白酶等介导的内皮细胞功能受损及心肌受损有关[3~4]。其中,凋亡在MIRI中起到很关键的作用。然而,迄今为止,尚未发现任何一种有效防止MIRI的方法。α-1抗胰蛋白酶(α-1 antitrypsin,A1AT)是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的一员,其主要作用是保护机体正常细胞和器官不受蛋白酶的损伤,抑制感染和炎症,维持机体内环境的平衡[5]。近年来,A1AT在干预炎症因子的治疗研究中愈来愈得到广大学者的青睐,目前已经广泛用于各种炎症疾病的治疗。本实验研究是在心肌缺血再灌注损伤学说的基础上,总结前人经验,建立小鼠心肌细胞缺氧/复氧模型,探索A1AT对小鼠缺氧/复氧心肌细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
导师组冻存小鼠心肌细胞(型号FMC84,来源:ATCC),caspase-3抗体购自CST。
1.2 检测方法
1.2.1 CCK-8检测法筛选A1AT最佳干预浓度及最佳干预时间
筛选A1AT最佳干预浓度实验分为 7个组:Blank组、Control组、H/R组、A1AT 10 μmol/L 组、A1AT 20 μmol/L 组、A1AT 40 μmol/L 组以及A1AT 80 μmol/L 组,按设定的浓度预先干预2小时,孔中换成4 mmol/L的Na2S2O4诱导缺氧1小时后,吸取Na2S2O4溶液弃掉,并予PBS清洗两次,予含有10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L及80 μmol/L的α-1抗胰蛋白酶的完全培养基复氧24小时,用CCK8检测它们的活力,筛选最佳α-1抗胰蛋白酶干预浓度。筛查A1AT最佳干预时间实验分为8个组:Blank组、Control组、H/R组、A1AT 1 h组、A1AT 2 h组、A1AT 4 h组、A1AT 6 h组及A1AT 12 h组,心肌细胞接种至96孔板中,以α-1抗胰蛋白酶最佳干预浓度干预,待细胞贴壁后,予20 μmol/L α-1抗胰蛋白酶分别干预1 h、2 h、4 h、6 h和12 h,到时间即去掉α-1抗胰蛋白酶药液,并予PBS清洗两次,予4 mmol/L Na2S2O4干预60 min建立小鼠心肌细胞缺氧模型,之后去掉Na2S2O4溶液,予完全培养基复氧24小时,进行CCK8检测。 1.2.2 利用流式细胞仪双染法检测细胞凋亡
我们利用流式细胞仪检测细胞凋亡,采用AnnexinV-FITC/PI双染法标记小鼠心肌细胞FMC84,对Control组、H/R组、A1AT组进行凋亡检测,收集细胞后在1小时内完成上机检测。设置四个象限,分别为1象限:此区域为机械损伤及坏死细胞;2象限:此区域为晚期凋亡细胞;3象限:此区域为存活细胞;4象限:其区域为早期凋亡细胞。以4象限细胞数来判定各组细胞早期凋亡程度。
1.2.3 利用免疫荧光检测caspase-3表达
按一定细胞浓度在24孔板种植细胞,待细胞爬片后以4%的聚甲醛固定,0.5% Triton 破膜,山羊血清封闭,之后以一抗4℃ 孵育过夜,加荧光二抗,滴加DAPI再染核,在荧光显微镜下观察采集图像。
1.2.4 Western Blot检测caspase-3表达
按一定的细胞浓度在6孔板中种植细胞,待细胞贴壁后进行造模及药物干预,收取细胞,提取蛋白,按提取的蛋白浓度在电泳槽中上样,跑电泳,转膜,一抗孵育过夜,孵育二抗,利用凝胶系统成像仪进行显影。
1.3 统计学方法
用Graphprism 5.0进行作图。应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析,计量资料符合正态分布,以均数±标准差( ±s )表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用 q 检验(Newman-Keuls法),检验水准:α=0.05,双侧检验。
2 结 果
2.1 A1AT干预心肌细胞缺氧/复氧的浓度梯度探索
与Blank组比较,不同浓度的A1AT均可不同程度地影响小鼠心肌细胞活力,其中A1AT 20 μmol/L 组的影响最明显。提示α-1抗胰蛋白酶20 μmol/L是最佳干预浓度。见表1。
2.2 A1AT干预心肌细胞缺氧/复氧的时间梯度探索
与Control组相比,α-1抗胰蛋白酶作用时间不同可对细胞活力造成不同的影响,其中A1AT 4 h组作用时间最佳,4小时后随着α-1抗胰蛋白酶作用时间越长,细胞活力逐渐下降。α-1抗胰蛋白酶4小时作用的OD值与对照组及A1AT 2 h组比较无统计学意义,但与其他作用时间组及H/R组比较差异均有统计学意义( P <0.05)。提示α-1抗胰蛋白酶干预的最佳时间为4小时。见表2。
2.3 流式细胞仪检测小鼠心肌细胞凋亡
与Control组比较,H/R组心肌细胞早期凋亡明显增加,A1AT干预后心肌细胞凋亡减少,差异有统计学意义( P <0.05)。结果提示Na2S2O4诱导的心肌细胞缺氧/复氧可以增加心肌细胞凋亡,A1AT预先干预后Na2S2O4诱导的心肌细胞缺氧/复氧心肌细胞早期凋亡减少(图1)。
2.4 免疫荧光检测小鼠心肌细胞caspase-3分子表达
caspase-3免疫荧光阳性为小鼠心肌细胞核呈现蓝色荧光物质。Control组、H/R组、A1AT组caspase-3的平均阳性表达率分别为19.16%,68.47%,35.52%,染色强度为弱阳性、强阳性、弱阳性,平均总积分分别为1分,5分,2.67分。Control组染色为阴性,H/R组及A1AT染色为阳性,且H/R组较A1AT组更为明显(图2),三组比较差异有统计学意义( P <0.05)。提示A1AT对MIRI细胞凋亡有保护作用。
2.5 Western Blot 检测小鼠心肌细胞 caspase-3蛋白表达
我们利用Western Blot 技术对caspase-3蛋白的表达水平进行检测,结果发现:与Control组比较,H/R组caspase-3表达明显上调,A1AT干预后其表达明显下调,三组比较差异有统计学意义( P <005)(图3)。说明A1AT对MIRI心肌细胞凋亡具有保护作用。
3 讨 论
MIRI后坏死心肌的面积增加了50%[2],但发生机制尚未完全明了,可能与氧化应激、炎症因子等介导的细胞凋亡有关[3~4]。由于MIRI預后差,危害大,对MIRI的治疗也成为当前医疗界的研究热点之一。
A1AT是急性反应性蛋白质,在炎症性疾患时,A1AT可透过毛细血管进入组织液,在炎症局部往往浓度很高,对急性炎性疾病有一定限制作用[6]。A1AT具有免疫调节、抗炎和细胞保护特性,与降低IL-6和IL-8的表达和成熟有关[7]。冠状动脉硬化症的发生与炎症因子密切相关,国外研究发现,血浆A1AT水平与心绞痛患者冠状动脉狭窄的存在和严重程度相关[8],还有研究发现,A1AT可以抑制IL-1的产生从而影响急性冠脉综合征的预后[9]。A1AT在干预炎症因子的治疗中愈来愈得到广大学者的青睐,目前已经广泛用于各种炎症疾病。因此,干预炎症因子对防治MIRI尤为重要。
缺血性心肌病大多数是由急性冠脉综合征演变而来,且其发生机制与氧自由基、炎症因子有关[10]。氧化应激是炎症的特征之一, 氧化应激不仅可以导致组织损伤, 还可以促进炎症反应[11]。氧化应激是炎症反应的特征表现之一,氧化应激导致的炎症反应在缺血再灌注损伤发生时爆发[12~13]。因此,阻断炎症反应及氧化应激可以在一定程度上减轻缺血再灌注损伤。炎症细胞因子的代表性家族为白介素家族,处于免疫反应及凋亡的上游,可以调控凋亡的发生,从而加剧缺血再灌注损伤[14]。我们的研究发现,心肌细胞缺氧/复氧后,细胞凋亡发生率明显减少,caspase-3表达明显增加,提示凋亡参与心肌缺血再灌注损伤的发生发展,这与王娓娓团队及李奇的研究一致[15~16]。近年来,随着临床药物的深入研究与应用发现,A1AT在控制炎症和免疫过程中起关键作用[17~18],我们的研究亦发现,心肌细胞缺氧/复氧予A1AT干预后,心肌细胞凋亡发生率明显下降,且caspase-3表达明显下降,这可能与A1AT可以有效干预炎症反应[19]进而抑制细胞凋亡有关。说明A1AT具有干预凋亡的作用,但目前这方面的研究甚少。但有国外报道A1AT可减少缺血再灌注引起的急性炎症损伤[20],有学者使用内皮细胞单层暴露于缺氧/复氧模型来研究A1AT在人脐静脉内皮细胞中的作用,结果发现 A1AT的过表达可抗氧化应激从而降低了细胞凋亡并促进了增殖[21]。 综上所述,凋亡是MIRI的关键环节,A1AT可以下调caspase-3,A1AT可能通过干预凋亡起到预防心肌缺血再灌注损伤的作用。
参 考 文 献
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(收稿日期:2021-04-13 修回日期:2021-07-23)
(編辑:梁明佩)