目的建立大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(ROBs)的胶原水凝胶三维立体培养模型。方法取新生SD大鼠颅骨,通过酶消化法获得成骨细胞。将传代培养的第一代(标记为P1代)ROBs与不同浓度Ⅰ型鼠尾胶原(胶原浓度为1、2、3mg/mL)、DMEM培养液、NaOH等混合,调节混合液pH并将其置于37℃使胶原凝固成形,建立细胞的三维立体培养。ROBs立体培养3d后,普通显微镜观察细胞形态及密度,培养6d后二乙酸荧光素/碘化丙啶(FDA/PI)染色法鉴定细胞存活率;培养3d、6d、9d后CCK-8检测法测定细胞活性,筛选出三维立体培养最佳胶原浓度及最佳培养体系。扫描电镜和HE染色观察最佳培养体系中ROBs细胞形态以及细胞与胶原复合物的黏附和分布情况。结果胶原浓度为2mg/mL培养体系,胶原成形最好、硬度最高。ROBs三维立体培养3d后,胶原浓度为1mg/mL、2mg/mL培养体系中细胞饱满、多呈长梭形。胶原浓度为3mg/mL的培养体系细胞多呈圆形并固缩。胶原浓度为2mg/mL培养体系中,细胞存活率最高(P<0.05),细胞活性强于1mg/mL组和3mg/mL组(P<0.05)。2mg/mL培养体系组扫描电镜结果显示细胞与胶原复合物黏附较好且细胞形态正常,HE染色结果显示细胞在胶原中分布均匀且细胞形态正常。结论胶原浓度为2mg/mL时,能够成功建立ROBs胶原水凝胶三维立体培养模型,该模型中胶原成形较好,硬度较高,细胞生存良好,分布均匀,能够维持正常形态及活性,适用于后期科学研究。