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摘要
以本实验室保存的重组质粒为模板，利用PCR方法扩增获得了甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的RNase3基因，RNase3基因由690个核苷酸组成，编码229个氨基酸。将RNase3基因克隆到原核表达载体pET28a（ ），转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导，对诱导产物进行SDSPAGE分析。结果表明，RNase3在大肠杆菌中能高效表达，融合蛋白分子量约为26.5 kD。以表达的融合蛋白为抗原，免疫家兔，制备了SPCSVRNase3的特异性抗血清。ACPELISA检测结果表明，制备的抗血清对RNase3融合蛋白的效价达10万倍。
关键词
甘薯褪绿矮化病毒； RNase3基因； 原核表达； 抗血清
中图分类号：
S 432.41
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017298
Prokaryotic expression of RNase3 of Sweet potato chlorotic stunt virus and
preparation of its antiserum
QIN Yanhong， QIAO Qi， WANG Shuang， ZHANG Desheng，
WANG Yongjiang， TIAN Yuting， ZHANG Zhenchen
（Institute of Plant Protection， Henan Academy of Agricultural Sciences， Henan Key Laboratory of
Crop Pest Control， Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southern Part of
North China， Ministry of Agriculture， Zhengzhou 450002， China）
Abstract
With the recombinant plasmid stored in our laboratory as template， RNase3 gene of Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV） was amplified by PCR. The fulllength RNase3 gene consists of 690 nt and encodes 229 amino acid residues. The RNase3 gene was cloned into expression vector pET28a（ ）for overexpression in prokaryotic cells. The recombinant plasmid pETRNase3 was transformed into Escherichia coli strain BL21（DE3）competent cells. SDSPAGE result showed that specific fusion protein with the molecular weight of about 26.5 kD was produced after induction by IPTG， indicating that the RNase3 fusion protein was highly expressed in prokaryotic cells. The expressed protein was purified from SDSPAGE and the antiserum against RNase3 protein was raised in rabbit. ACPELISA detection indicated that the titer of RNase3 antiserum was over 1∶100000 against RNase3 fusion protein.
Key words
Sweet potato chlorotic stunt virus； RNase3 gene； prokaryotic expression； antiserum
甘薯是重要的糧食作物、食品加工原料和新型能源作物。我国甘薯种植面积位居世界第一[1]。病毒病对甘薯产业造成很大影响。研究表明，我国甘薯上至少存在甘薯褪绿矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV）和甘薯羽状斑驳病毒Sweet potato feathery mottle virus （SPFMV）等20余种病毒[26]。SPCSV与SPFMV共同侵染可引起甘薯复合病毒病（Sweet potato virus disease，SPVD），该病可使甘薯减产50%～98%，甚至绝收[7]。2010年，Qiao等首次报道了SPCSV在我国发生[8]。2012年，张振臣等首次证明我国甘薯上已发生SPVD[9]。近年来，SPCSV在我国的发生面积逐渐扩大，在全国范围内迅速蔓延，对甘薯的危害日趋严重，是甘薯上危害最严重的病毒之一。
SPCSV隶属长线形病毒科Closteroviridae毛形病毒属Crinivirus，基因组为两条单链正义RNA，RNA1编码蛋白主要参与病毒的复制，RNA2编码蛋白主要负责病毒的包装和运输。RNA1上编码的RNase3蛋白是其基因沉默抑制子，RNase3蛋白包含一个核糖核酸内切酶结构域和一个双链RNA结合结构域，RNase3可以抑制由正义RNA介导的RNA干扰（RNAi），在体外，RNase3可以将21、22和24 nt的siRNA切割成14 nt，RNase3的核糖核酸内切酶活性对其沉默抑制活性是必需的[11]。RNase3蛋白还能够增强p22蛋白的沉默抑制活性[12]，研究表明，RNase3单独即可介导SPCSV与SPFMV等其他病毒的协生作用[11]。目前，对SPVD致病机理方面的研究还较薄弱，关于SPCSV与SPFMV等病毒协生作用的分子机理还不十分清楚，因此，本研究针对SPCSV编码的RNase3这一重要蛋白，利用原核表达的策略，在大肠杆菌中表达了RNase3的融合蛋白，制备了SPCSV RNase3的多克隆抗体。 1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌JM109和BL21（DE3）菌株，含RNase3基因的重组质粒SPCSVRNA144108637T[10]和原核表达载体pET28a（ ）均由本实验室保存；UNIQ10柱式DNA胶回收试剂盒购自Axygen公司；氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、IPTG和SDS等购自上海生工生物工程有限公司；质粒小量抽提试剂盒购自Omega生物科技公司；Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA分子量标准和蛋白质分子量标准等购自宝生物工程（大连）有限公司；其他常用试剂为国产分析纯。
根据本实验室测定的重组质粒序列[10]，设计扩增RNase3基因的引物，正向引物RNase3Bam HⅠ5F的序列为5′CGTGGATCCATGATTCCGATCTTTTCTGAT3′），与RNase3基因的1-21 nt位置对应并引入BamHⅠ酶切位点，反向引物RNase3HindⅢ3R的序列为5′GGCAAGCTTTCAATTCAAATTTAGAGCTTCGAC3′，与RNase3的终止密码子附近序列互补并引入了HindⅢ酶切位点，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 SPCSV RNase3基因的PCR扩增
以重组质粒SPCSVRNA144108637T为模板，以RNase3BamHⅠ5F和RNase3HindⅢ3R为引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：正、反向引物各1 μL， 2.5 mmol/L的dNTP混合物4 μL，10×Ex Taq buffer 5 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL，重组质粒1 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，按照Axygen公司UNIQ10柱式DNA胶回收试剂盒的说明书回收目的片段。
1.2.2 SPCSV RNase3基因原核表达载体的构建及序列测定
将1.2.1中的胶回收产物用BamHⅠ和HindⅢ酶切后与相应酶切的pET28a（ ）载体连接。将连接产物转化至大肠杆菌JM109，提取质粒，经PCR扩增和酶切筛选出重组质粒，将重组质粒pETRNase3送上海生工生物工程技术有限公司测序以验证阅读框架的正确性。
1.2.3 SPCSV RNase3蛋白的诱导表达及SDSPAGE分析
将读框正确的重组质粒pETRNase3及空载体pET28a（ ）转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取单菌落于2 mL LB培养液中（含100 μg/mL Kan），37℃振荡培养过夜，将过夜培养的菌液按1∶100稀释到新鲜的LB培养液中（含100 μg/mL Kan），振蕩培养至OD600达到0.6以上，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，于37℃继续诱导6～8 h。取1.5 mL培养液，经10 000 r/min离心1 min收集菌体，用50 μL灭菌ddH2O悬浮，加入50 μL 2×的样品缓冲液 （40 mmol/L TrisHCl，10%甘油，2%SDS，5%巯基乙醇，0.1%溴酚蓝，pH 6.8），颠倒混匀后，煮沸10 min，用12.5%的胶进行SDSPAGE分析。
1.2.4 SPCSV RNase3抗血清的制备和效价测定
1.2.3中的原核表达产物经SDSPAGE电泳后，将凝胶用预冷的染色液（0.25 mol/L KCl，1 mmol/L DTT）染色至条带清晰，切下所需的蛋白条带，加入等体积0.85%的生理盐水，于冰浴中研磨。12 000 r/min离心5 min，收集上清即为回收到的蛋白。利用回收的蛋白免疫家兔，经过6次免疫后，获得抗血清。利用ACPELISA对抗血清进行效价测定。免疫家兔等工作由郑州博赛生物技术公司协助完成。
2 结果与分析
2.1 SPCSV RNase3基因原核表达载体构建及表达产物SDSPAGE分析
利用PCR扩增获得大小约为690 bp目的条带，将目的片段割胶回收，将胶回收产物和pET28a（ ）质粒分别利用BamHⅠ和HindⅢ酶切后进行连接，转化大肠杆菌JM109，菌液PCR验证为阳性的样品，提取质粒后再进行酶切鉴定（图1a），并送上海生工生物工程有限公司测序，证明阅读框架正确，表明原核表达载体pETRNase3构建成功。
将pETRNase3和pET28a（ ）分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，利用IPTG诱导表达，分别以未诱导的pETRNase3和诱导的pET28a（ ）为对照。经过SDSPAGE分析表明，含有重组质粒的工程菌诱导后可产生大小约为26.5 kD的目的蛋白，而对照没有相应条带（图1b），表明RNase3在大肠杆菌中得到了表达。
2.2 SPCSV RNase3抗血清的制备和效价测定
以纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔，经过6次免疫后获得了SPCSVRNase3的抗血清，以RNase3的融合蛋白为抗原，利用ACPELISA对抗血清的效价进行测定，结果表明，抗血清稀释100 000倍后仍能与抗原发生阳性反应（表1）。
3 讨论
研究表明，SPCSV可以与多种甘薯病毒发生协生作用，使甘薯的症状加重，其他病毒的含量增加[1316]，RNase3介导了这一过程。表达植物病毒蛋白最常见的就是大肠杆菌表达体系，它具有产量高、成本低、生产周期短、表达稳定等优点，本研究利用原核表达的方法制备了SPCSVRNase3蛋白的抗血清，该抗血清对RNase3融合蛋白的效价可达100 000以上，可以用于RNase3融合蛋白的检测。 利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体，是目前抗体研究中普遍采用的一种方法，制备的抗体可以用于内源蛋白的表达水平分析、蛋白质的体外互作分析、免疫胶体金定位分析等试验[17]。因此，下一步可以通过Western blot技术利用制备的特异性抗体对RNase3在甘薯不同部位的分布和表达量的差异开展研究；另外，还可以通过酵母双杂交技术筛选与SPCSVRNase3互作的其他协生病毒蛋白或寄主因子，将表达的融合蛋白应用于RNase3蛋白与其他蛋白的体外互作验证。本研究为后续SPCSV的致病机理研究提供了材料，为探索新的抗病毒策略奠定基础。
参考文献
[1] MA D， LI H M， TANG J， et al. Current status and future prospects of development of sweet potato industry in China [C]∥Sweet Potato in Food and Energy Security： Proceedings of China Xuzhou 4th International Sweet Potato Symposium
以本实验室保存的重组质粒为模板，利用PCR方法扩增获得了甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的RNase3基因，RNase3基因由690个核苷酸组成，编码229个氨基酸。将RNase3基因克隆到原核表达载体pET28a（ ），转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导，对诱导产物进行SDSPAGE分析。结果表明，RNase3在大肠杆菌中能高效表达，融合蛋白分子量约为26.5 kD。以表达的融合蛋白为抗原，免疫家兔，制备了SPCSVRNase3的特异性抗血清。ACPELISA检测结果表明，制备的抗血清对RNase3融合蛋白的效价达10万倍。
关键词
甘薯褪绿矮化病毒； RNase3基因； 原核表达； 抗血清
中图分类号：
S 432.41
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017298
Prokaryotic expression of RNase3 of Sweet potato chlorotic stunt virus and
preparation of its antiserum
QIN Yanhong， QIAO Qi， WANG Shuang， ZHANG Desheng，
WANG Yongjiang， TIAN Yuting， ZHANG Zhenchen
（Institute of Plant Protection， Henan Academy of Agricultural Sciences， Henan Key Laboratory of
Crop Pest Control， Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southern Part of
North China， Ministry of Agriculture， Zhengzhou 450002， China）
Abstract
With the recombinant plasmid stored in our laboratory as template， RNase3 gene of Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV） was amplified by PCR. The fulllength RNase3 gene consists of 690 nt and encodes 229 amino acid residues. The RNase3 gene was cloned into expression vector pET28a（ ）for overexpression in prokaryotic cells. The recombinant plasmid pETRNase3 was transformed into Escherichia coli strain BL21（DE3）competent cells. SDSPAGE result showed that specific fusion protein with the molecular weight of about 26.5 kD was produced after induction by IPTG， indicating that the RNase3 fusion protein was highly expressed in prokaryotic cells. The expressed protein was purified from SDSPAGE and the antiserum against RNase3 protein was raised in rabbit. ACPELISA detection indicated that the titer of RNase3 antiserum was over 1∶100000 against RNase3 fusion protein.
Key words
Sweet potato chlorotic stunt virus； RNase3 gene； prokaryotic expression； antiserum
甘薯是重要的糧食作物、食品加工原料和新型能源作物。我国甘薯种植面积位居世界第一[1]。病毒病对甘薯产业造成很大影响。研究表明，我国甘薯上至少存在甘薯褪绿矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV）和甘薯羽状斑驳病毒Sweet potato feathery mottle virus （SPFMV）等20余种病毒[26]。SPCSV与SPFMV共同侵染可引起甘薯复合病毒病（Sweet potato virus disease，SPVD），该病可使甘薯减产50%～98%，甚至绝收[7]。2010年，Qiao等首次报道了SPCSV在我国发生[8]。2012年，张振臣等首次证明我国甘薯上已发生SPVD[9]。近年来，SPCSV在我国的发生面积逐渐扩大，在全国范围内迅速蔓延，对甘薯的危害日趋严重，是甘薯上危害最严重的病毒之一。
SPCSV隶属长线形病毒科Closteroviridae毛形病毒属Crinivirus，基因组为两条单链正义RNA，RNA1编码蛋白主要参与病毒的复制，RNA2编码蛋白主要负责病毒的包装和运输。RNA1上编码的RNase3蛋白是其基因沉默抑制子，RNase3蛋白包含一个核糖核酸内切酶结构域和一个双链RNA结合结构域，RNase3可以抑制由正义RNA介导的RNA干扰（RNAi），在体外，RNase3可以将21、22和24 nt的siRNA切割成14 nt，RNase3的核糖核酸内切酶活性对其沉默抑制活性是必需的[11]。RNase3蛋白还能够增强p22蛋白的沉默抑制活性[12]，研究表明，RNase3单独即可介导SPCSV与SPFMV等其他病毒的协生作用[11]。目前，对SPVD致病机理方面的研究还较薄弱，关于SPCSV与SPFMV等病毒协生作用的分子机理还不十分清楚，因此，本研究针对SPCSV编码的RNase3这一重要蛋白，利用原核表达的策略，在大肠杆菌中表达了RNase3的融合蛋白，制备了SPCSV RNase3的多克隆抗体。 1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌JM109和BL21（DE3）菌株，含RNase3基因的重组质粒SPCSVRNA144108637T[10]和原核表达载体pET28a（ ）均由本实验室保存；UNIQ10柱式DNA胶回收试剂盒购自Axygen公司；氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、IPTG和SDS等购自上海生工生物工程有限公司；质粒小量抽提试剂盒购自Omega生物科技公司；Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA分子量标准和蛋白质分子量标准等购自宝生物工程（大连）有限公司；其他常用试剂为国产分析纯。
根据本实验室测定的重组质粒序列[10]，设计扩增RNase3基因的引物，正向引物RNase3Bam HⅠ5F的序列为5′CGTGGATCCATGATTCCGATCTTTTCTGAT3′），与RNase3基因的1-21 nt位置对应并引入BamHⅠ酶切位点，反向引物RNase3HindⅢ3R的序列为5′GGCAAGCTTTCAATTCAAATTTAGAGCTTCGAC3′，与RNase3的终止密码子附近序列互补并引入了HindⅢ酶切位点，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 SPCSV RNase3基因的PCR扩增
以重组质粒SPCSVRNA144108637T为模板，以RNase3BamHⅠ5F和RNase3HindⅢ3R为引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：正、反向引物各1 μL， 2.5 mmol/L的dNTP混合物4 μL，10×Ex Taq buffer 5 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL，重组质粒1 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，按照Axygen公司UNIQ10柱式DNA胶回收试剂盒的说明书回收目的片段。
1.2.2 SPCSV RNase3基因原核表达载体的构建及序列测定
将1.2.1中的胶回收产物用BamHⅠ和HindⅢ酶切后与相应酶切的pET28a（ ）载体连接。将连接产物转化至大肠杆菌JM109，提取质粒，经PCR扩增和酶切筛选出重组质粒，将重组质粒pETRNase3送上海生工生物工程技术有限公司测序以验证阅读框架的正确性。
1.2.3 SPCSV RNase3蛋白的诱导表达及SDSPAGE分析
将读框正确的重组质粒pETRNase3及空载体pET28a（ ）转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取单菌落于2 mL LB培养液中（含100 μg/mL Kan），37℃振荡培养过夜，将过夜培养的菌液按1∶100稀释到新鲜的LB培养液中（含100 μg/mL Kan），振蕩培养至OD600达到0.6以上，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，于37℃继续诱导6～8 h。取1.5 mL培养液，经10 000 r/min离心1 min收集菌体，用50 μL灭菌ddH2O悬浮，加入50 μL 2×的样品缓冲液 （40 mmol/L TrisHCl，10%甘油，2%SDS，5%巯基乙醇，0.1%溴酚蓝，pH 6.8），颠倒混匀后，煮沸10 min，用12.5%的胶进行SDSPAGE分析。
1.2.4 SPCSV RNase3抗血清的制备和效价测定
1.2.3中的原核表达产物经SDSPAGE电泳后，将凝胶用预冷的染色液（0.25 mol/L KCl，1 mmol/L DTT）染色至条带清晰，切下所需的蛋白条带，加入等体积0.85%的生理盐水，于冰浴中研磨。12 000 r/min离心5 min，收集上清即为回收到的蛋白。利用回收的蛋白免疫家兔，经过6次免疫后，获得抗血清。利用ACPELISA对抗血清进行效价测定。免疫家兔等工作由郑州博赛生物技术公司协助完成。
2 结果与分析
2.1 SPCSV RNase3基因原核表达载体构建及表达产物SDSPAGE分析
利用PCR扩增获得大小约为690 bp目的条带，将目的片段割胶回收，将胶回收产物和pET28a（ ）质粒分别利用BamHⅠ和HindⅢ酶切后进行连接，转化大肠杆菌JM109，菌液PCR验证为阳性的样品，提取质粒后再进行酶切鉴定（图1a），并送上海生工生物工程有限公司测序，证明阅读框架正确，表明原核表达载体pETRNase3构建成功。
将pETRNase3和pET28a（ ）分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，利用IPTG诱导表达，分别以未诱导的pETRNase3和诱导的pET28a（ ）为对照。经过SDSPAGE分析表明，含有重组质粒的工程菌诱导后可产生大小约为26.5 kD的目的蛋白，而对照没有相应条带（图1b），表明RNase3在大肠杆菌中得到了表达。
2.2 SPCSV RNase3抗血清的制备和效价测定
以纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔，经过6次免疫后获得了SPCSVRNase3的抗血清，以RNase3的融合蛋白为抗原，利用ACPELISA对抗血清的效价进行测定，结果表明，抗血清稀释100 000倍后仍能与抗原发生阳性反应（表1）。
3 讨论
研究表明，SPCSV可以与多种甘薯病毒发生协生作用，使甘薯的症状加重，其他病毒的含量增加[1316]，RNase3介导了这一过程。表达植物病毒蛋白最常见的就是大肠杆菌表达体系，它具有产量高、成本低、生产周期短、表达稳定等优点，本研究利用原核表达的方法制备了SPCSVRNase3蛋白的抗血清，该抗血清对RNase3融合蛋白的效价可达100 000以上，可以用于RNase3融合蛋白的检测。 利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体，是目前抗体研究中普遍采用的一种方法，制备的抗体可以用于内源蛋白的表达水平分析、蛋白质的体外互作分析、免疫胶体金定位分析等试验[17]。因此，下一步可以通过Western blot技术利用制备的特异性抗体对RNase3在甘薯不同部位的分布和表达量的差异开展研究；另外，还可以通过酵母双杂交技术筛选与SPCSVRNase3互作的其他协生病毒蛋白或寄主因子，将表达的融合蛋白应用于RNase3蛋白与其他蛋白的体外互作验证。本研究为后续SPCSV的致病机理研究提供了材料，为探索新的抗病毒策略奠定基础。
参考文献
[1] MA D， LI H M， TANG J， et al. Current status and future prospects of development of sweet potato industry in China [C]∥Sweet Potato in Food and Energy Security： Proceedings of China Xuzhou 4th International Sweet Potato Symposium