【摘 要】
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目的 构建携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)基因的腺病毒表达载体(Ad-VEGF165),并观察其感染QBI-293A靶细胞后日的基囚的表达及促进血管形成的作用.方法 以含有VEGF16
【机 构】
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苏州大学附属儿童医院心内科,苏州大学基础医学系细胞与分子生物学教研室
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目的 构建携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)基因的腺病毒表达载体(Ad-VEGF165),并观察其感染QBI-293A靶细胞后日的基囚的表达及促进血管形成的作用.方法 以含有VEGF165基因片段的pSV-K3-VEGF165质粒为模板,PCR扩增获得的VEGF165目的 片段(Xho l、EcoR V)亚克隆至GFP标记的pAdTrack-CMV载体中构建重组转移质粒pAdTrack-CMV-VEGF165,行PCR、双酶切和DNA测序鉴定.将测序正确的pAdTrack-CMV-VEGF165质粒经Pine I线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-VEGF165(pAd-VEGF165).再经Pac I线性化后用脂质体转染QBI-293A包装细胞,通过多轮扩增和氯化铯密度梯度离心纯化获得Ad-VEGF165重组腺病毒.RT-PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性VEGF165基因在QBI-293A细胞中的转录和表达.将孵育8d的生长状态良好的鸡胚随机分成Ad空载体腺病毒组、Ad-VEGF165重组腺病毒组、NS组.采用鸡胚尿囊膜(CAM)法检测VEGF165重组腺病毒促进尿囊膜血管形成活性.结果 PCR、双酶切和测序鉴定结果 证实成功构建了pAdTrack-CMV VEGF165重组转移质粒,并获得了高滴度的Ad-VEGF165重组腺病毒,其病毒效价可达2×1010pfu/mL.Ad-VEGF165感染后,QBI-293A细胞中的VEGF165含量较QBI-293A细胞对照组和Ad空病毒感染组均明显升高(P
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