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[摘要] 目的 探讨脐血间充质干细胞（mesnchymal stem cells，MSCs）移植对脑梗死大鼠的影响及作用机制。 方法 体外培养脐血间充质干细胞并采用流式细胞仪检测细胞免疫表型，利用线栓法制作大鼠脑梗死模型；将120只大鼠随机分成MSCs移植组、对照组；对大鼠进行神经功能评价；Western-blot检测GFAP蛋白的表达。荧光显微镜观察大鼠海马结构变化及MSCs在大鼠脑内的分布。 结果 神经功能检测MSCs移植组神经功能评分降低，对照组神经功能评分升高，差异有统计学意义（P<0.05）。MSCs移植组GFAP的表达量升高，7 d达高峰，对照组无明显变化（P<0.05）。MSCs移植组MSCs在大鼠脑内分布良好，海马结构层次清晰，对照组海马神经组织结构紊乱，神经突触及细胞器溶解破坏。 结论 MSCs可促进大鼠脑梗死后神经功能恢复及海马结构的修复，增强神经可塑性。
[关键词] 脐血间充质干细胞；脑梗死；神经可塑性
[中图分类号] R743.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）14-0021-03
[Abstract] Objective To explore the effects and mechanism of implantation of umbilical blood mesenchymal stem cells （MSCs） on rats with cerebral infarction. Methods Umbilical blood MSCs were cultured in vivo， flow cytometry was applied to test cytometric immunophenotype， and model of rat cerebral infarction was made by suture method； 120 rats were randomly assigned to MSCs implantation group and control group； rats’ neurological function was evaluated； western-blot was applied to test the expression of GFAP protein. Fluorescence microscope was applied to observe changes of hippocampal formation in rats as well as the distribution of MSCs in rats’ brain. Results According to the test of neurological function， the score of neurological function in the experiment group was reduced， and the score in the control group was improved. The difference was statistically significant （P<0.05）. Expression of GFAP in MSCs implantation group was increased with a peak in the 7th day， while no significant changes in the control group （P<0.05）. According to the observation of immunofluorescence microscopy， the distribution of MSCs in rats’ brain was good in MSCs implantation group， and the hippocampal formation showed clear layers in the experiment group. Hippocampal structures in the control group were chaotic， and synapses and organelles were dissolved and compromised. Conclusion MSCs are able to promote the repair of hippocampal structures after cerebral infarction in rats， strengthen neuroplasticity and promote the recovery of neurological functions.
[Key words] Umbilical blood mesenchymal stem cells （MSCs）； Cerebral infarction； Neuroplasticity
脐血间充质干细胞（MSCs）有跨胚层分化潜能，可分化为神经细胞[1，2]。研究发现激活神经干细胞不是脑梗死的直接结果，而是引起了脑内某些因子的变化，进而作用于神经干细胞使其增殖、分化和迁移[3]。本实验采用线栓法制备大鼠脑梗死模型，通过观察脐血干细胞移植对大鼠脑损伤后神经胶质酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）蛋白表达的影响及移植前后神经功能缺损评分、海马结构的变化，旨在探讨MSCs移植治疗脑梗死的可能机制，为临床治疗脑梗死提供理论依据。
1材料与方法
1.1模型制备
将河南省实验动物中心提供的120只雄性SD大鼠[动物合格证号SCXX（豫）2010-0002]于2013年3月～2014年3月进行实验，将大鼠随机分成MSCs移植组和对照组，每组60只，制备脑梗死模型。采用线栓法将大鼠制成大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。激光多普勒血流仪监测大鼠大脑中动脉血流速度，如血流速度较栓塞前降低70%以上及Zealonga评分>1分，提示制模成功。 1.2主要仪器与试剂
免疫荧光显微镜，脑立体定位仪（NARISHIGE SN-3 型，日本）。
1.3 MSCs培养
取新鲜的脐血，淋巴细胞分离液提取单个核细胞，分装到2个50 mL培养瓶中，每瓶中加5 mL培养基，放于培养箱中培养，2～3 d后洗去没有贴壁的细胞并更换新鲜的培养液，以倒置显微镜观察细胞的生长状况。贴壁细胞完全融合以后，以2.5 g/L的胰酶消化并传代，把传至第2代的细胞接种在第2个6孔板内，每孔细胞浓度为1×105/mL，达到80%共融时再加入诱导剂。
1.4神经功能评分
Berderson评分标准：无神经损伤，0分；大鼠瘫痪侧前肢屈曲腹下，1分；除了1分体征外，瘫痪侧推大鼠阻力下降，2分；有追尾现象，3分。除上述体征外，大鼠活动量减少，4分。大鼠得分为0～4分。分别于术后6 h、24 h、3 d、7 d、14 d不同时间点对大鼠神经功能评分。2～4分者说明模型复制成功。选取2分以上的模型大鼠用于后续实验。
1.5免疫组化及免疫荧光
取大鼠脑组织，40 g/L多聚甲醛固定，行常规冰冻切片，对切片进行HE染色及免疫荧光显微镜观察。每张切片随机选取6个200倍视野，Simple-PCI图像分析系统，测定阳性细胞数，计算均值。
1.6统计学分析
采用SPSS16.0软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验或方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
MSCs移植组与对照组均于术后2～3 d内活动减少，体重减轻，3 d后体重开始增加，皮毛光泽及亮度均好转，精神状态亦明显改善，自主活动增加。MSCs移植组恢复较对照组快。
术后6 hMSCs移植组和对照组均出现神经功能障碍，到第14天时，对照组大鼠神经评分仍然在2分以上。MSCs移植组在6 h、24 h、3 d、7 d、14 d不同时间点进行比较，差异有统计学意义（P=0.0027<0.01），对照组在6 h、24 h、3 d、7 d、14 d比较差异无统计学意义（P=0.0630>0.05）。由此可见，随着MSCs的持续治疗，MSCs移植组脑出血大鼠神经功能逐步恢复，对照组则无明显变化。见表1。
大鼠脑组织病理观察及免疫组化观察海马区域神经生成见图1、2。Western blot 观察GFAP蛋白的表达见图3。
3 讨论
脑梗死引起的神经元不可逆死亡，梗死区周边的成熟神经元不能再生，因此脑梗死预后不佳。MSCs在某些微环境作用下具有类似胚胎干细胞的高度分化潜能，研究发现，MSCs移植于受损动物的脑组织中，可促进动物神经功能的恢复[4]。因而采用MSCs移植治疗脑梗死成为研究热点。
本实验表明，造模后MSCs移植组和对照组大鼠出现功能及行为异常，病变对侧肢体出现不同程度的瘫痪，表现为追尾现象、不能站立等，功能异常程度与病变严重程度一致。对照组与MSCs移植组比较，3 d、7 d、14 d后神经功能评分对照组高于MSCs移植组（P<0.05）。说明MSCs可明显改善脑梗死大鼠的神经功能障碍，其具体机制尚不明确，可能与脑水肿减轻、颅内压的降低和脑出血灶吸收有关。移植2周后，大鼠脑梗死灶周边可见绿色荧光细胞，说明MSCs可在大鼠脑组织中存活。研究表明，MSCs移植到大脑不同部位后，能根据大鼠脑内的微环境变化来分化不同脑区的神经细胞[5]。海马主要与记忆功能相关，是学习的重要结构，尤其是近期的记忆功能，其损伤范围与障碍程度成正比[6]，所以，本实验选取海马作为研究部位。免疫组化显示MSCs移植组大鼠海马结构层次清晰，而对照组则紊乱，无规则。GFAP是近来广泛受到重视的脑损伤应检测的神经特异性标志物，也是神经干细胞（neural stem cell，NSC）分化的标记物[7]，检测GFAP可以早期反映大脑损伤，也可以直接反映移植效果。Western blot显示，在同一时间点，与对照组比较，MSCs移植组GFAP蛋白表达升高，7 d达到高峰期，随后开始下降。这说明移植MSCs可能抑制了星形胶质细胞的过度增生，减轻脑梗死后胶质瘢痕的形成，使星形胶质细胞适度活化以发挥其损伤修复作用，因此我们认为MSCs移植后抑制胶质瘢痕的形成是脑梗死大鼠神经功能恢复的机制之一，究其机制可能是MSCs通过释放细胞因子而调节GFAP的表达，进而影响神经功能的恢复。
MSCs促使脑组织功能恢复的机制尚不清楚，Chen等[8]研究发现MSCs移植治疗脑梗死后，脑内仅有1%～2%的MSCs表达神经元标志物，5%表达星形胶质细胞标志物。神经系统功能恢复很难简单地用这些细胞分化为有功能的神经细胞来解释，目前认为，MSCs移植修复受损脑组织的机制极其复杂，即有MSCs分泌细胞因子及神经因子的调节作用，又有分化为神经样细胞产生的替代作用，同时还有因新生血管改善供氧条件等影响[9]。本研究根据MSCs移植后海马结构的变化及GFAP表达量，初步探讨了MSCs向神经样细胞分化、代替坏死神经细胞、进而促进神经功能恢复的作用，而这些神经样细胞能否真正代替坏死神经细胞，机体又如何发挥调控作用，什么时间移植效果最好，尚需进一步探讨。
[参考文献]
[1] Heo JS，Choi SM，Kim HO，et al. Neural transdifferentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells on hydrophobic polymer-modified surface and therapeutic effects in an animal model of ischemic stroke[J]. Neuro-science，2013，238（6）：305-318. [2] Manley NC，Steinberg GK.Tracking stem cells for cellular therapy in stoke[J]. Curre Pharm Des，2012，18（25）：3685-3693.
[3] Zhu W，Zhou LF，Wang Y，et al. Transplantation of gene-transfected neural stem cells for transient cerebral ischemia in rats[J]. Natl Med J China，2004，84（12）：12-17.
[4] Pereanu W，Younossi Hartenstein A，Lovick J，et al. Lineage-based analysis of the development of the central complex of the Drosophila brain[J]. The Journal of Comparative Neurology，2011，519（4）：661-689.
[5] 董富兴，胡莹莹，刘亚萍，等. 新生大鼠海马神经干细胞的离体培养及细胞连接的超微结构观察[J]. 重庆医学，2013，42（11）：1201-1203.
[6] 胡晶琼，欧阳为相，李慧玉，等. 间充质干细胞治疗脊髓小脑性共济失调[J]. 中国组织工程研究，2013，27（5）：5019-5025.
[7] Zechariah A，Elali A，Doeppner TR，et al. Vascular endothelial growth factor promotes pericyte coverage of brain capillaries，improves cerebral blood flow during subsequent focal cerebral ischemia and preserves the metabolic penumbra[J]. Stroke，2013，30（4）：224-229.
[8] Chen J，LI Y，Wang L，et al. Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats[J]. Neurol Sci，2001，189（7）：49-57.
[9] Bae KS，Park JB，Kim HS，et al. Neuron-like differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J]. Yonsei Med J，2011，52（3）：401-412.
（收稿日期：2014-11-28）
[关键词] 脐血间充质干细胞；脑梗死；神经可塑性
[中图分类号] R743.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）14-0021-03
[Abstract] Objective To explore the effects and mechanism of implantation of umbilical blood mesenchymal stem cells （MSCs） on rats with cerebral infarction. Methods Umbilical blood MSCs were cultured in vivo， flow cytometry was applied to test cytometric immunophenotype， and model of rat cerebral infarction was made by suture method； 120 rats were randomly assigned to MSCs implantation group and control group； rats’ neurological function was evaluated； western-blot was applied to test the expression of GFAP protein. Fluorescence microscope was applied to observe changes of hippocampal formation in rats as well as the distribution of MSCs in rats’ brain. Results According to the test of neurological function， the score of neurological function in the experiment group was reduced， and the score in the control group was improved. The difference was statistically significant （P<0.05）. Expression of GFAP in MSCs implantation group was increased with a peak in the 7th day， while no significant changes in the control group （P<0.05）. According to the observation of immunofluorescence microscopy， the distribution of MSCs in rats’ brain was good in MSCs implantation group， and the hippocampal formation showed clear layers in the experiment group. Hippocampal structures in the control group were chaotic， and synapses and organelles were dissolved and compromised. Conclusion MSCs are able to promote the repair of hippocampal structures after cerebral infarction in rats， strengthen neuroplasticity and promote the recovery of neurological functions.
[Key words] Umbilical blood mesenchymal stem cells （MSCs）； Cerebral infarction； Neuroplasticity
脐血间充质干细胞（MSCs）有跨胚层分化潜能，可分化为神经细胞[1，2]。研究发现激活神经干细胞不是脑梗死的直接结果，而是引起了脑内某些因子的变化，进而作用于神经干细胞使其增殖、分化和迁移[3]。本实验采用线栓法制备大鼠脑梗死模型，通过观察脐血干细胞移植对大鼠脑损伤后神经胶质酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）蛋白表达的影响及移植前后神经功能缺损评分、海马结构的变化，旨在探讨MSCs移植治疗脑梗死的可能机制，为临床治疗脑梗死提供理论依据。
1材料与方法
1.1模型制备
将河南省实验动物中心提供的120只雄性SD大鼠[动物合格证号SCXX（豫）2010-0002]于2013年3月～2014年3月进行实验，将大鼠随机分成MSCs移植组和对照组，每组60只，制备脑梗死模型。采用线栓法将大鼠制成大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。激光多普勒血流仪监测大鼠大脑中动脉血流速度，如血流速度较栓塞前降低70%以上及Zealonga评分>1分，提示制模成功。 1.2主要仪器与试剂
免疫荧光显微镜，脑立体定位仪（NARISHIGE SN-3 型，日本）。
1.3 MSCs培养
取新鲜的脐血，淋巴细胞分离液提取单个核细胞，分装到2个50 mL培养瓶中，每瓶中加5 mL培养基，放于培养箱中培养，2～3 d后洗去没有贴壁的细胞并更换新鲜的培养液，以倒置显微镜观察细胞的生长状况。贴壁细胞完全融合以后，以2.5 g/L的胰酶消化并传代，把传至第2代的细胞接种在第2个6孔板内，每孔细胞浓度为1×105/mL，达到80%共融时再加入诱导剂。
1.4神经功能评分
Berderson评分标准：无神经损伤，0分；大鼠瘫痪侧前肢屈曲腹下，1分；除了1分体征外，瘫痪侧推大鼠阻力下降，2分；有追尾现象，3分。除上述体征外，大鼠活动量减少，4分。大鼠得分为0～4分。分别于术后6 h、24 h、3 d、7 d、14 d不同时间点对大鼠神经功能评分。2～4分者说明模型复制成功。选取2分以上的模型大鼠用于后续实验。
1.5免疫组化及免疫荧光
取大鼠脑组织，40 g/L多聚甲醛固定，行常规冰冻切片，对切片进行HE染色及免疫荧光显微镜观察。每张切片随机选取6个200倍视野，Simple-PCI图像分析系统，测定阳性细胞数，计算均值。
1.6统计学分析
采用SPSS16.0软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验或方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
MSCs移植组与对照组均于术后2～3 d内活动减少，体重减轻，3 d后体重开始增加，皮毛光泽及亮度均好转，精神状态亦明显改善，自主活动增加。MSCs移植组恢复较对照组快。
术后6 hMSCs移植组和对照组均出现神经功能障碍，到第14天时，对照组大鼠神经评分仍然在2分以上。MSCs移植组在6 h、24 h、3 d、7 d、14 d不同时间点进行比较，差异有统计学意义（P=0.0027<0.01），对照组在6 h、24 h、3 d、7 d、14 d比较差异无统计学意义（P=0.0630>0.05）。由此可见，随着MSCs的持续治疗，MSCs移植组脑出血大鼠神经功能逐步恢复，对照组则无明显变化。见表1。
大鼠脑组织病理观察及免疫组化观察海马区域神经生成见图1、2。Western blot 观察GFAP蛋白的表达见图3。
3 讨论
脑梗死引起的神经元不可逆死亡，梗死区周边的成熟神经元不能再生，因此脑梗死预后不佳。MSCs在某些微环境作用下具有类似胚胎干细胞的高度分化潜能，研究发现，MSCs移植于受损动物的脑组织中，可促进动物神经功能的恢复[4]。因而采用MSCs移植治疗脑梗死成为研究热点。
本实验表明，造模后MSCs移植组和对照组大鼠出现功能及行为异常，病变对侧肢体出现不同程度的瘫痪，表现为追尾现象、不能站立等，功能异常程度与病变严重程度一致。对照组与MSCs移植组比较，3 d、7 d、14 d后神经功能评分对照组高于MSCs移植组（P<0.05）。说明MSCs可明显改善脑梗死大鼠的神经功能障碍，其具体机制尚不明确，可能与脑水肿减轻、颅内压的降低和脑出血灶吸收有关。移植2周后，大鼠脑梗死灶周边可见绿色荧光细胞，说明MSCs可在大鼠脑组织中存活。研究表明，MSCs移植到大脑不同部位后，能根据大鼠脑内的微环境变化来分化不同脑区的神经细胞[5]。海马主要与记忆功能相关，是学习的重要结构，尤其是近期的记忆功能，其损伤范围与障碍程度成正比[6]，所以，本实验选取海马作为研究部位。免疫组化显示MSCs移植组大鼠海马结构层次清晰，而对照组则紊乱，无规则。GFAP是近来广泛受到重视的脑损伤应检测的神经特异性标志物，也是神经干细胞（neural stem cell，NSC）分化的标记物[7]，检测GFAP可以早期反映大脑损伤，也可以直接反映移植效果。Western blot显示，在同一时间点，与对照组比较，MSCs移植组GFAP蛋白表达升高，7 d达到高峰期，随后开始下降。这说明移植MSCs可能抑制了星形胶质细胞的过度增生，减轻脑梗死后胶质瘢痕的形成，使星形胶质细胞适度活化以发挥其损伤修复作用，因此我们认为MSCs移植后抑制胶质瘢痕的形成是脑梗死大鼠神经功能恢复的机制之一，究其机制可能是MSCs通过释放细胞因子而调节GFAP的表达，进而影响神经功能的恢复。
MSCs促使脑组织功能恢复的机制尚不清楚，Chen等[8]研究发现MSCs移植治疗脑梗死后，脑内仅有1%～2%的MSCs表达神经元标志物，5%表达星形胶质细胞标志物。神经系统功能恢复很难简单地用这些细胞分化为有功能的神经细胞来解释，目前认为，MSCs移植修复受损脑组织的机制极其复杂，即有MSCs分泌细胞因子及神经因子的调节作用，又有分化为神经样细胞产生的替代作用，同时还有因新生血管改善供氧条件等影响[9]。本研究根据MSCs移植后海马结构的变化及GFAP表达量，初步探讨了MSCs向神经样细胞分化、代替坏死神经细胞、进而促进神经功能恢复的作用，而这些神经样细胞能否真正代替坏死神经细胞，机体又如何发挥调控作用，什么时间移植效果最好，尚需进一步探讨。
[参考文献]
[1] Heo JS，Choi SM，Kim HO，et al. Neural transdifferentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells on hydrophobic polymer-modified surface and therapeutic effects in an animal model of ischemic stroke[J]. Neuro-science，2013，238（6）：305-318. [2] Manley NC，Steinberg GK.Tracking stem cells for cellular therapy in stoke[J]. Curre Pharm Des，2012，18（25）：3685-3693.
[3] Zhu W，Zhou LF，Wang Y，et al. Transplantation of gene-transfected neural stem cells for transient cerebral ischemia in rats[J]. Natl Med J China，2004，84（12）：12-17.
[4] Pereanu W，Younossi Hartenstein A，Lovick J，et al. Lineage-based analysis of the development of the central complex of the Drosophila brain[J]. The Journal of Comparative Neurology，2011，519（4）：661-689.
[5] 董富兴，胡莹莹，刘亚萍，等. 新生大鼠海马神经干细胞的离体培养及细胞连接的超微结构观察[J]. 重庆医学，2013，42（11）：1201-1203.
[6] 胡晶琼，欧阳为相，李慧玉，等. 间充质干细胞治疗脊髓小脑性共济失调[J]. 中国组织工程研究，2013，27（5）：5019-5025.
[7] Zechariah A，Elali A，Doeppner TR，et al. Vascular endothelial growth factor promotes pericyte coverage of brain capillaries，improves cerebral blood flow during subsequent focal cerebral ischemia and preserves the metabolic penumbra[J]. Stroke，2013，30（4）：224-229.
[8] Chen J，LI Y，Wang L，et al. Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats[J]. Neurol Sci，2001，189（7）：49-57.
[9] Bae KS，Park JB，Kim HS，et al. Neuron-like differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J]. Yonsei Med J，2011，52（3）：401-412.
（收稿日期：2014-11-28）