【摘 要】
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目的构建重组表达质粒pcDNA3. 1-rTNSALP-FcD10及p EF1-rTNSALP-FcD10,获得能够稳定表达rTNSALP-FcD10蛋白的CHO-K1细胞株。方法去除重组人非组织特异碱性磷酸酶(tissue-nons
【机 构】
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济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院; 山东省医药生物技术研究中心国家卫生部生物技术药物重点实验室山东省罕少见病重点实验室;
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目的构建重组表达质粒pcDNA3. 1-rTNSALP-FcD10及p EF1-rTNSALP-FcD10,获得能够稳定表达rTNSALP-FcD10蛋白的CHO-K1细胞株。方法去除重组人非组织特异碱性磷酸酶(tissue-nonspecific alkaline phosphatase,TNSALP)多钛链C端氨基酸连接IgG1的Fc片段及10个天冬氨酸,构建目的基因rhALP-FcD10,将基因分别克隆至pcDNA3. 1及p EF1/Myc-His B载体上,均转化E. coli DH5α细胞;将签定正确的两组重组质粒均转染CHO-K1细胞,进行G418压力筛选,建立稳定转染的CHO-K1细胞系,采用RT-qPCR及Western blot方法检测细胞中rTNSALPFcD10 mRNA转录水平及蛋白表达量。结果重组质粒pcDNA3. 1-rTNSALP-FcD10及pEF1-rTNSALP-FcD10经双酶切鉴定证明构建正确;G418最低致死浓度确定为800μg/m L;CHO-K1细胞中rTNSALP-FcD10 m RNA转录及蛋白水平均高于空白对照组,差异均有统计学意义(P <0. 01);转染p EF1-rTNSALP-FcD10组的蛋白表达量较转染pcDNA3. 1-rTNSALP-FcD10组高。结论成功构建了rTNSALP-FcD10的重组表达质粒pcDNA3. 1-rTNSALP-FcD10及pEF1-rTNSALP-FcD10,获得了稳定转染的CHO-K1细胞系,成功表达目的蛋白rTNSALP-FcD10,为蛋白进一步纯化奠定了良好的实验基础。
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