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花药培养(简称花培)育种,是将离体花粉培育成单倍体植株,再经染色体自然或人工加倍得到纯合二倍体的一种育种方法；通过该法获得的纯合二倍体在遗传上非常稳定,不发生性状分离,因此,花培育种能提早稳定分离后代、缩短育种年限。随着科学的发展,花药培养的意义不断扩大,可广泛应用于基础生物科学和育种领域。(1)在基础科学领域,花药培养不仅已成为生理,生化和遗传研究常用的重要手段,而且对于实验胚胎学、生理学及分子生物学中基因调控、表达机理的阐明有重要意义；同时,花药培养建立的双单倍体群体——DH群体,具有遗传学上的纯合基因组,是AFLP,RAPD,SSR等分子标记和基因图谱的理想材料,可避免二倍体中由于不完全自交,使染色体上DNA碱基的细微差别造成的干扰,大大提高基因定位、标图的准确性。(2)在育种领域,花培育种已与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及转基因技术相结合,是生物技术在农作物育种中应用最广泛、最有成效的方法之一。本文从玉米花药培养的概况、影响花药培养效率的主要因素以及花药培养在玉米育种中的应用等几个方面加以介绍，旨在为进一步开展玉米花药培养研究提供参考。
一、玉米花药培养研究概况
自1964年印度Guha等从茄科植物毛曼陀罗(Datura innoxia)的离体花药中成功诱导出单倍体植株以来，这一方法被广泛应用到28科68属170多种植物上。我国自1974年初首次成功诱导玉米花粉植株，1977年，广西玉米研究所与中国科学院植物研究所协作获得第一株纯合的玉米花粉自交果穗以来，曾一度掀起了玉米花培育种热潮，许多学者对影响玉米花培反应的各种因素如基因型、花粉发育时期、培养基等进行了大量研究，也获得了花培自交系并育成了杂交种应用于生产。如继谷明光等(1975)诱导出第一批玉米花粉植株之后,杭玲等(1991)先后培育出玉米花培杂交种桂三1号和桂花1号。桂三1号于1992年通过广西壮族自治区品种审定,这是国内外用花培方法育成的第一个玉米杂交种。杨宪民(1995)利用玉米花培纯系选育出优良杂交种花单1号。山东农业大学利用花培单倍体育种技术体系成功地选育出糯玉米杂交种山农花糯1号（王启柏，2002）。北京市植物细胞工程实验室玉米花培育种课题也取得了可喜的绩,获得了自交系种子（郭奕明，2001）。他们利用育成的玉米花培自交系配制的组合,抗病性强,杆粗穗大，抗倒伏。随着花药培养技术的发展，花培育种已与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及转基因技术相结合，发展成一套独特的育种技术体系。花培育种是生物技术在农作物育种应用最广泛、最有效的方法之一，在传统农业向高技术农业的转化中发挥着纽带作用，是一种快速有效的育种途径。
二、影响花药培养效率的主要因素
1.试验材料
1.1 供试材料的基因型
基因型是影响花药培养的主要因素之一。不同基因型的花药对培养的反应不同。杭玲等（1985）研究发现，接种不同材料，诱导率差异相当大。在接种的241份杂交组合中，诱导出愈伤组织的材料为212份，占总接种材料的88%，各种材料的诱导率差异幅度为0.02%-100%。何雪银等（2004）对14份糯玉米材料的花培反应率进行离体培养，有13份材料具有花培反应，占参试材料的92.85%，出愈率在3.16~0.06%；对10份优质蛋白玉米材料的花培反应率进行离体培养，有5份具有花培反应，占参试材料的50%，出愈率在0.65~0.11%。这说明在基因组内,可能存在着可调控小孢子发育的基因。
1.2 供试材料的生理状态
供试材料的生理状态、植株年龄、植株健壮程度、植株生长发育的生态环境（光照、温度、大气湿度）等各方面的因素会直接影响到愈伤组织的形成。谷明光等（1988）认为，取样日期不同，诱导物产生频率差异很大。曹孜义等还认为，即使同一天取样时间不同，诱导率都不同。郭奕明等发现，生长在大田和温室中以及在不同季节里的玉米，在培养过程中诱导频率都有很大差异，所以应尽量使供体植物的种植标准化。根据一般经验，在适宜条件下生长的健康植株，其花药和花粉培养的胚诱导率和植株再生率高。从季节上看，冬春季较夏秋季更适合进行花药培养，这可能是温度与光周期共同作用的结果。
1.3 花粉发育时期的影响
花粉发育时期是诱导小孢子分裂的关键时期。只有花粉发育到一定时期的花药,才对外界刺激敏感。而不同植物的花粉对外界刺激的敏感时期是不同的,如水稻、烟草的花粉,从单核中期到双核期皆可接受诱导,而玉米的花粉,以单核中后期为佳。此时的玉米花药长度约4mm,颜色呈淡绿色。
2.培养基成分的影响
2.1基本培养基
基本培养基是花药培养中影响花粉启动和再分化的重要条件，培养基对花药培养的成败影响很大。在玉米花培的早期,中国科学家对各种基本培养基配方进行了评估(Chu,1981;Ku,1981)。此后,N6、玉培、正14等培养基在玉米中都经常用,效果也差不多。1982年，杭玲等用正交试验方法对培养基的大量元素进行调整试验，筛选出“82-1”培养基，与N6、正14、玉培等培养基相比，他们认为“82-1”培养基比较适合玉米花药产生愈伤组织，能使80%的参试材料产生愈伤组织或胚状体。杭玲还指出，“82-1”培养基还不是最理想的培养基，要选择出能广泛适于各种基因型材料产生更多的愈伤组织或胚状体的培养基，仍需继续做更多试验。
2.2 培养基的附加物质
2.2.1植物激素 在花药培养中,调节激素成分不但可影响花粉发育类型,而且还可以影响到二倍体的体细胞组织生长增殖。各种研究表明,生长素(特别是2,4-D)和细胞分裂素(特别是KT或BA)的适当比例,能促进孢子体的小孢子发育。一般诱导培养基用生长素的适宜浓度为2mg/L,而分化培养基用生长素的适宜浓度为0.5mg/L。
2.2.2氨基酸 在培养基中加入适量的氨基酸，如丙氨酸、丝氨酸、L-羟脯氨酸，L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸等氨基酸，可以促进愈伤组织和胚状体的发生。 2.2.3 糖 糖作为培养基中的主要碳源，它不单是调节渗透压，对花粉脱分化和再分化产生有利效应。有研究报道，蔗糖浓度在12~15%是花粉脱分化培养基最好浓度，再分化的培养基的蔗糖浓度在5~6%较适宜（王子霞，2001）。
3.预处理的影响
日前，低温预处理已成为一项广为采用的提高花药诱导率的措施。低温处理时间视使用的温度而定。较低的温度处理时间短，较高的温度处理时间长。典型的玉米花药处理时间为4~14℃处理7~14d(Nitsch等,1982;Genovesi和Collins,1982;Dieu和Beck2ert,1986,Tsay等,1986)。
4.培养条件
4.1光照
离体花药对光照的反应是不同的。一般认为,花药培养在诱导愈伤组织进行暗培养或给以散射光处理比较好。在分化培养期间，在光强为2000Lx，每天光照10个小时为宜。
4.2温度
培养条件中最主要的是温度。离体花药对温度比较敏感,是诱导小孢子发育的关键因素。研究表明，诱导培养适宜的温度范围在25~28℃，分化培养的适宜温度范围在23~26℃。
4.3接种密度
由于花药在培养基上存在营养竞争关系,呼吸代谢等相互作用,因此，接种密度直接影响愈伤组织的诱导频率和发育。玉米花药培养中，每支试管接种30~50枚花药的接种密度较为合适。
三、花药培养在育种中应用
1.种质材料创新
利用花药培养可以克服远缘杂交的困难。远缘杂交作为一种育种手段，能引入不同种、属的有用基因，为改良现有品种提供了一条重要的途径。然而在远缘杂交过程中，却存在着杂交不易成功、杂种一代不育或育性低和杂种后代性状分离幅度大或“疯狂”分离，时间长，不易稳定三大困难。通过花药培养，虽然不能解决上述第一困难，但能克服第二、第三种困难。在远缘杂种的花粉中也有少数有发育能力，或者早期是正常的，这可以通过花药培养，获得花粉植株，克服上述二者困难。
2.在诱变育种中的应用
花药培养在诱变育种研究中具有特殊的作用。细胞诱变筛选育种无疑为育种家提供了一条较为便捷的育种途径。利用体细胞进行诱变筛选，由于体细胞中染色体成对存在，要想使发生了突变的基因尽快纯合并表现出来，还需要经过一些自交过程，而利用花药培养则可以加快诱变突变体的表现进程。如胡忠等、庄承纪等对水稻离体花药及其花粉植株进行化学诱变或辐射诱变,获得了早熟、矮杆突变系。花药培养中获得变异体的频率较高,目前在应用各种选择压进行诱变并筛选抗寒、抗盐碱等变异系方面, 都有良好的进展。如郑祖玲等用稻瘟病病原菌粗提毒素作为选择压,将不抗稻瘟病的水稻品种花寒早、桂农12等的花药,接种在有稻瘟病生理小种F1、E3粗毒素的培养基上培养,获得了能抗这2个稻瘟病生理小种的花粉植株株系;Faedi等在培养Pajaro品种的草莓花药时发现,再生植株中存在无性系变异,所获得的1484株植株中,36株表现高产、大果和低感病性。
3.在抗病育种中的应用
花药培养和抗病育种紧密结合,导入抗病基因,是培育抗病品种的有效方法之一。由于二倍体花粉植株来源于单倍体,控制病害抗性的基因已经纯合,抗、感病特性十分明显,因而就能很快地将符合育种目标的抗病株系挑选出来,从而育成抗病品种。聂道泰等在中间偃麦草与小麦杂交的衍生材料中发现“中5”具有中间偃麦草的高抗黄矮病和对条锈病免疫的性状,因而以“中5”为外源抗性基因供体,通过花药培养,快速创制出稳定的小麦条锈病和黄矮病抗性新种质；野生稻ST221抗稻瘟病、感白叶枯病,RBB16则抗白叶枯病、感稻瘟病,而普通栽培稻对2种病都不抗,庞汉华等通过栽培稻与野生稻杂交、花粉植株培养,培育出综合了野生稻亲本抗性的野栽稻杂交后代。应用同样的方法,还可将其它的抗性基因导入到优良品种中去。
4.在转基因育种中的应用
将目的基因转入单倍体材料,更容易鉴定和筛选具有外源基因的材料。小孢子作为外源基因的受体,可以通过离体培养直接获得纯合的转基因材料,使目的基因易于表达。与常规育种、分子育种相结合,拓宽花培育种的应用领域。把分子标记辅助育种与花培技术紧密结合起来,既可以显著提高培养效率,快速纯合植物基因型,尽快获得纯合转基因植物,同时也扩大了花培技术的应用范畴。
四、存在问题
植物花药培养研究取得了很大进展,但是在实际应用和扩大花药培养的基因型范围方面,还有许多工作要做。
1.诱导频率和分化成苗率低
对于多数植物来讲,能形成有活力胚的花药百分率很低。通常花药或花粉离体培养时没有生长和发育迹象,或刚开始生长便导致胚败育,大量畸形胚状体出现,愈伤组织分化能力低,白化苗难以避免，因此，难以获得足够的选择群体而严重限制了该技术在育种实践中的应用。因此,大幅度提高玉米花药培养效率,获得大量的加倍纯系,是目前玉米花药培养育种中急需解决的问题。
2.培养方法没有达到普遍的最优化
培养基成分及培养条件间相互作用关系不清楚，胚状体或愈伤组织的诱导率和分化率较低，不定芽生长能力差，结果造成成苗率低，植物再生周期长，白化苗增多等，这些尚有待进一步深入研究，以建立玉米花药培养的最适体系。
3.花药培养易受到体细胞的干扰
在花药培养过程中，花药壁、绒毡层组织会不可避免地通过愈伤组织阶段形成胚状体。目前主要通过提高蔗糖浓度，减少或不用2，4-D来诱导花粉愈伤组织，而采用NAA和6-BA配合使用来避免体细胞对花药培养的干扰，但对一些植物种类效果不明显，没有从根本上解决问题，这给染色体倍性鉴定带来了麻烦，所以如何有效的控制体细胞干扰，需要进一步的研究。
总之，花药培养技术是迄今为止创造纯合基因型的最有效手段之一，加强花药培养体系中关键技术和遗传机理的研究，使花药培养与基因工程相结合，解决花药培养对基因的依赖性，提高花药培养效率，将为花药培养的应用开创一个新的局面。 参考文献：
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中国科学院北京植物所.1997.植物单倍体育种{M}.北京科学技术出版社.
作者简介：何雪银（1978-），女，壮族，广西横县人，助理研究员，硕士，主要从事玉米遗传育种研究及科研管理工作。
一、玉米花药培养研究概况
自1964年印度Guha等从茄科植物毛曼陀罗(Datura innoxia)的离体花药中成功诱导出单倍体植株以来，这一方法被广泛应用到28科68属170多种植物上。我国自1974年初首次成功诱导玉米花粉植株，1977年，广西玉米研究所与中国科学院植物研究所协作获得第一株纯合的玉米花粉自交果穗以来，曾一度掀起了玉米花培育种热潮，许多学者对影响玉米花培反应的各种因素如基因型、花粉发育时期、培养基等进行了大量研究，也获得了花培自交系并育成了杂交种应用于生产。如继谷明光等(1975)诱导出第一批玉米花粉植株之后,杭玲等(1991)先后培育出玉米花培杂交种桂三1号和桂花1号。桂三1号于1992年通过广西壮族自治区品种审定,这是国内外用花培方法育成的第一个玉米杂交种。杨宪民(1995)利用玉米花培纯系选育出优良杂交种花单1号。山东农业大学利用花培单倍体育种技术体系成功地选育出糯玉米杂交种山农花糯1号（王启柏，2002）。北京市植物细胞工程实验室玉米花培育种课题也取得了可喜的绩,获得了自交系种子（郭奕明，2001）。他们利用育成的玉米花培自交系配制的组合,抗病性强,杆粗穗大，抗倒伏。随着花药培养技术的发展，花培育种已与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及转基因技术相结合，发展成一套独特的育种技术体系。花培育种是生物技术在农作物育种应用最广泛、最有效的方法之一，在传统农业向高技术农业的转化中发挥着纽带作用，是一种快速有效的育种途径。
二、影响花药培养效率的主要因素
1.试验材料
1.1 供试材料的基因型
基因型是影响花药培养的主要因素之一。不同基因型的花药对培养的反应不同。杭玲等（1985）研究发现，接种不同材料，诱导率差异相当大。在接种的241份杂交组合中，诱导出愈伤组织的材料为212份，占总接种材料的88%，各种材料的诱导率差异幅度为0.02%-100%。何雪银等（2004）对14份糯玉米材料的花培反应率进行离体培养，有13份材料具有花培反应，占参试材料的92.85%，出愈率在3.16~0.06%；对10份优质蛋白玉米材料的花培反应率进行离体培养，有5份具有花培反应，占参试材料的50%，出愈率在0.65~0.11%。这说明在基因组内,可能存在着可调控小孢子发育的基因。
1.2 供试材料的生理状态
供试材料的生理状态、植株年龄、植株健壮程度、植株生长发育的生态环境（光照、温度、大气湿度）等各方面的因素会直接影响到愈伤组织的形成。谷明光等（1988）认为，取样日期不同，诱导物产生频率差异很大。曹孜义等还认为，即使同一天取样时间不同，诱导率都不同。郭奕明等发现，生长在大田和温室中以及在不同季节里的玉米，在培养过程中诱导频率都有很大差异，所以应尽量使供体植物的种植标准化。根据一般经验，在适宜条件下生长的健康植株，其花药和花粉培养的胚诱导率和植株再生率高。从季节上看，冬春季较夏秋季更适合进行花药培养，这可能是温度与光周期共同作用的结果。
1.3 花粉发育时期的影响
花粉发育时期是诱导小孢子分裂的关键时期。只有花粉发育到一定时期的花药,才对外界刺激敏感。而不同植物的花粉对外界刺激的敏感时期是不同的,如水稻、烟草的花粉,从单核中期到双核期皆可接受诱导,而玉米的花粉,以单核中后期为佳。此时的玉米花药长度约4mm,颜色呈淡绿色。
2.培养基成分的影响
2.1基本培养基
基本培养基是花药培养中影响花粉启动和再分化的重要条件，培养基对花药培养的成败影响很大。在玉米花培的早期,中国科学家对各种基本培养基配方进行了评估(Chu,1981;Ku,1981)。此后,N6、玉培、正14等培养基在玉米中都经常用,效果也差不多。1982年，杭玲等用正交试验方法对培养基的大量元素进行调整试验，筛选出“82-1”培养基，与N6、正14、玉培等培养基相比，他们认为“82-1”培养基比较适合玉米花药产生愈伤组织，能使80%的参试材料产生愈伤组织或胚状体。杭玲还指出，“82-1”培养基还不是最理想的培养基，要选择出能广泛适于各种基因型材料产生更多的愈伤组织或胚状体的培养基，仍需继续做更多试验。
2.2 培养基的附加物质
2.2.1植物激素 在花药培养中,调节激素成分不但可影响花粉发育类型,而且还可以影响到二倍体的体细胞组织生长增殖。各种研究表明,生长素(特别是2,4-D)和细胞分裂素(特别是KT或BA)的适当比例,能促进孢子体的小孢子发育。一般诱导培养基用生长素的适宜浓度为2mg/L,而分化培养基用生长素的适宜浓度为0.5mg/L。
2.2.2氨基酸 在培养基中加入适量的氨基酸，如丙氨酸、丝氨酸、L-羟脯氨酸，L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸等氨基酸，可以促进愈伤组织和胚状体的发生。 2.2.3 糖 糖作为培养基中的主要碳源，它不单是调节渗透压，对花粉脱分化和再分化产生有利效应。有研究报道，蔗糖浓度在12~15%是花粉脱分化培养基最好浓度，再分化的培养基的蔗糖浓度在5~6%较适宜（王子霞，2001）。
3.预处理的影响
日前，低温预处理已成为一项广为采用的提高花药诱导率的措施。低温处理时间视使用的温度而定。较低的温度处理时间短，较高的温度处理时间长。典型的玉米花药处理时间为4~14℃处理7~14d(Nitsch等,1982;Genovesi和Collins,1982;Dieu和Beck2ert,1986,Tsay等,1986)。
4.培养条件
4.1光照
离体花药对光照的反应是不同的。一般认为,花药培养在诱导愈伤组织进行暗培养或给以散射光处理比较好。在分化培养期间，在光强为2000Lx，每天光照10个小时为宜。
4.2温度
培养条件中最主要的是温度。离体花药对温度比较敏感,是诱导小孢子发育的关键因素。研究表明，诱导培养适宜的温度范围在25~28℃，分化培养的适宜温度范围在23~26℃。
4.3接种密度
由于花药在培养基上存在营养竞争关系,呼吸代谢等相互作用,因此，接种密度直接影响愈伤组织的诱导频率和发育。玉米花药培养中，每支试管接种30~50枚花药的接种密度较为合适。
三、花药培养在育种中应用
1.种质材料创新
利用花药培养可以克服远缘杂交的困难。远缘杂交作为一种育种手段，能引入不同种、属的有用基因，为改良现有品种提供了一条重要的途径。然而在远缘杂交过程中，却存在着杂交不易成功、杂种一代不育或育性低和杂种后代性状分离幅度大或“疯狂”分离，时间长，不易稳定三大困难。通过花药培养，虽然不能解决上述第一困难，但能克服第二、第三种困难。在远缘杂种的花粉中也有少数有发育能力，或者早期是正常的，这可以通过花药培养，获得花粉植株，克服上述二者困难。
2.在诱变育种中的应用
花药培养在诱变育种研究中具有特殊的作用。细胞诱变筛选育种无疑为育种家提供了一条较为便捷的育种途径。利用体细胞进行诱变筛选，由于体细胞中染色体成对存在，要想使发生了突变的基因尽快纯合并表现出来，还需要经过一些自交过程，而利用花药培养则可以加快诱变突变体的表现进程。如胡忠等、庄承纪等对水稻离体花药及其花粉植株进行化学诱变或辐射诱变,获得了早熟、矮杆突变系。花药培养中获得变异体的频率较高,目前在应用各种选择压进行诱变并筛选抗寒、抗盐碱等变异系方面, 都有良好的进展。如郑祖玲等用稻瘟病病原菌粗提毒素作为选择压,将不抗稻瘟病的水稻品种花寒早、桂农12等的花药,接种在有稻瘟病生理小种F1、E3粗毒素的培养基上培养,获得了能抗这2个稻瘟病生理小种的花粉植株株系;Faedi等在培养Pajaro品种的草莓花药时发现,再生植株中存在无性系变异,所获得的1484株植株中,36株表现高产、大果和低感病性。
3.在抗病育种中的应用
花药培养和抗病育种紧密结合,导入抗病基因,是培育抗病品种的有效方法之一。由于二倍体花粉植株来源于单倍体,控制病害抗性的基因已经纯合,抗、感病特性十分明显,因而就能很快地将符合育种目标的抗病株系挑选出来,从而育成抗病品种。聂道泰等在中间偃麦草与小麦杂交的衍生材料中发现“中5”具有中间偃麦草的高抗黄矮病和对条锈病免疫的性状,因而以“中5”为外源抗性基因供体,通过花药培养,快速创制出稳定的小麦条锈病和黄矮病抗性新种质；野生稻ST221抗稻瘟病、感白叶枯病,RBB16则抗白叶枯病、感稻瘟病,而普通栽培稻对2种病都不抗,庞汉华等通过栽培稻与野生稻杂交、花粉植株培养,培育出综合了野生稻亲本抗性的野栽稻杂交后代。应用同样的方法,还可将其它的抗性基因导入到优良品种中去。
4.在转基因育种中的应用
将目的基因转入单倍体材料,更容易鉴定和筛选具有外源基因的材料。小孢子作为外源基因的受体,可以通过离体培养直接获得纯合的转基因材料,使目的基因易于表达。与常规育种、分子育种相结合,拓宽花培育种的应用领域。把分子标记辅助育种与花培技术紧密结合起来,既可以显著提高培养效率,快速纯合植物基因型,尽快获得纯合转基因植物,同时也扩大了花培技术的应用范畴。
四、存在问题
植物花药培养研究取得了很大进展,但是在实际应用和扩大花药培养的基因型范围方面,还有许多工作要做。
1.诱导频率和分化成苗率低
对于多数植物来讲,能形成有活力胚的花药百分率很低。通常花药或花粉离体培养时没有生长和发育迹象,或刚开始生长便导致胚败育,大量畸形胚状体出现,愈伤组织分化能力低,白化苗难以避免，因此，难以获得足够的选择群体而严重限制了该技术在育种实践中的应用。因此,大幅度提高玉米花药培养效率,获得大量的加倍纯系,是目前玉米花药培养育种中急需解决的问题。
2.培养方法没有达到普遍的最优化
培养基成分及培养条件间相互作用关系不清楚，胚状体或愈伤组织的诱导率和分化率较低，不定芽生长能力差，结果造成成苗率低，植物再生周期长，白化苗增多等，这些尚有待进一步深入研究，以建立玉米花药培养的最适体系。
3.花药培养易受到体细胞的干扰
在花药培养过程中，花药壁、绒毡层组织会不可避免地通过愈伤组织阶段形成胚状体。目前主要通过提高蔗糖浓度，减少或不用2，4-D来诱导花粉愈伤组织，而采用NAA和6-BA配合使用来避免体细胞对花药培养的干扰，但对一些植物种类效果不明显，没有从根本上解决问题，这给染色体倍性鉴定带来了麻烦，所以如何有效的控制体细胞干扰，需要进一步的研究。
总之，花药培养技术是迄今为止创造纯合基因型的最有效手段之一，加强花药培养体系中关键技术和遗传机理的研究，使花药培养与基因工程相结合，解决花药培养对基因的依赖性，提高花药培养效率，将为花药培养的应用开创一个新的局面。 参考文献：
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作者简介：何雪银（1978-），女，壮族，广西横县人，助理研究员，硕士，主要从事玉米遗传育种研究及科研管理工作。