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摘要：目的：研究hepaCAM基因对结肠癌细胞Colo205增殖和周期的影响。方法：用腺病毒向结肠癌细胞Colo205导入肝细胞黏附分子（Hepa-tocytecelladhesionmolecule，hepaCAM），以RT-qPCR及westernblot检测hepaCAMmRNA及蛋白水平，MTT测细胞生存率，FCM测细胞周期及凋亡。结果：RT-qPCR及westernblot显示：hepaCAM基因在结肠癌细胞Colo205中呈现低表达状态，向细胞导入hepaCAM基因后，MTT显示：实验组生存率显著降低（P<0.01）。FCM证实：实验组出现明显G2/M期阻滞，但细胞凋亡尚未到达统计学意义。结论：hepaCAM基因可显著抑制人类结肠癌Colo205细胞的增殖，并将细胞阻滞于G2/M期，从而产生抗肿瘤作用。
关键词：结肠癌;肝细胞黏附分子;抑制率;细胞周期
中国图书分类法分类号：
文献标志码：
收稿日期：
Abstract：Objective：Toinvestigatethebiologicaleffectsofhepa-tocytecelladhesionmolecule
o205.Methods：AfterinfectedwithadenoviruspAdH5-hepaCAMorpAdH5，RT-qPCRandwesternblotwereusedtodetectthemRNAandproteinexpressionsofhepaCAM，MTTassaywasusedtoobservethesurvivalratesofcellsindifferentgroups，FCMwasusedtoanalyzethechangesofcellcycleandapoptosisinColo205.Results：RT-qPCRandwesternblotshowedthatmRNAandproteinlevelsofhepaCAMweredown-regulatedinColo205.AfterinfectedwithadenoviruspAdH5-hepaCAM，theexpressionlevelofhep
-regulateddramatically.MTTassayshowedthatthesurvivalratewasmarkedlydecreased（P<0.01），andInFCMassay，aremarkableG2/MphasearrestwasseeninpAdH5-hepaCAMgroup.Conclusion：AfterintroductionofhepaCAMgene，aremarkablegrowthinhibitionandG2/Mphasearrestcanbeobserved，whichmightbethereasonoftusionbyhepaCAMinhumancoloncarcinomacell.
Keywords：carcinomaofcolon;hepa-tocytecelladhesionmolecule;inhibitionrate;cellcycle
结肠癌是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，近年来，我国结肠癌的发病率有明显增高的趋势。由于结肠癌常起病隐匿，许多患者获得诊断时肿瘤已出现了不同程度的扩散与转移[1，2]。尽管各种治疗决策不断改进，但结肠癌的治疗仍然是一大挑战[1]。基因突变已经被确认为癌症发生的重要标志，因此，开展结肠癌基因治疗研究具有重大意义。ShaliS[3]等研究发现肝细胞黏附分子（hepa-tocytecelladhesionmolecule，hepaCAM）是一种免疫球蛋白类细胞黏附分子，它具有抑制肿瘤生长及增殖的作用。它在乳腺癌、肾癌、膀胱癌等多种肿瘤组织中表达水平明显下降，上调其表达可显示出显著的肿瘤抑制效应[4-7]。而hepaCAM在结肠癌中的研究目前尚存在空白。本研究将检测hepaCAM基因在结肠癌细胞Colo205中的表达水平，并将外源性hepaCAM基因导入Colo205细胞，观察其对肿瘤细胞增殖与周期的影响，为结肠癌的基因治疗探索新的思路。
1材料与方法
1.1材料
腺病毒pAdH5-hepaCAM、空载腺病毒pAdH5及结肠癌细胞系Colo205由本室保存。Trizol、逆转录试剂盒、SYBRGreenⅡ荧光定量PCR试剂盒及DNAmarker购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由Invitrogen公司合成。MTT、胰酶、二甲基亚砜购自Sigma公司。hepaCAM抗体购自LifespanBiosciences公司。β-actin抗体购自SantaCruz公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养及腺病毒感染。待Colo205细胞复苏后，置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。当培养瓶中细胞长至70%时，弃去旧培养液，向培养瓶中加入无血清的RPMI-1640培养液，滴入病毒，放入培养箱培养，半小时后将培养瓶中的培养液轻轻摇匀，继续培养，1.5h后向培养瓶中加入等量的含10%小牛血清的RPMI-1640培养液，感染24h后观察细胞病变（CPE）。将细胞分为3组：实验组（Colo205/pAdH5-hepaCAM组）、空载组（Colo205/pAdH5组）和空白对照组（Colo205组），以备后续实验。
1.2.2实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测hepaCAM基因的mRNA含量。用Trizol提取不同组的总RNA，用逆转录试剂盒将所提RNA逆转录为cDNA，并于-20℃备用。根据hepaCAM、β-actin的序列设计其引物，以β-actin为内参。hepaCAM正义链：5’-TACTGTAGATGTGCCCATTTCG-3’，反义链：5’-CTTCTGGTTTCAGGCGGTC-3’，产物长度461bp;β-actin正义链：5’-ACGAGACCACCTTCAACTCCATC-3’，反义链：5’-TAGAAGCATTTGCGGTGGACGA-3’，产物长度304bp。HepaCAM的PCR扩增条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共40个循环。β-actin的PCR扩增条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共40个循环。 1.2.3Westernblot检测hepaCAM的蛋白表达。各组细胞用预冷的PBS洗3遍，加入预冷的RIPA裂解液，提取细胞总蛋白。测定蛋白浓度后，加入适量蛋白上样缓冲液，煮沸5min后于-80℃保存。SDS-PAGE凝胶电泳时每孔加入等量蛋白，转膜后用5%脱脂奶粉常温下封闭4h，一抗4℃过夜，洗膜后加入生物素标记的二抗，室温孵1h，最后化学发光法显色。
1.2.4MTT检测各组Colo205细胞的增殖能力。将细胞分3组接种于96孔板中，每孔3000个细胞，接种首日细胞贴壁后用腺病毒处理实验组与空载组，导入基因，并将此设为第一个检测点，以后每24h检测一次，共连续检测5d。测定时每孔加入20μlMTT（5mg/ml），继续培养4h后弃去培养液，每孔再加入150μl的DMSO，于摇床上振荡10min，使蓝紫色结晶完全溶解。用酶联免疫检测仪在490nm处检测其吸光度D值，计算出各组的细胞抑制率，计算公式为：生存率（%）=某组某日所测得的平均吸光度D值/该组首日测得的平均吸光度D值×100%。
1.2.5FCM检测细胞周期。向Colo205细胞导入hepaCAM基因，48h后，将各组细胞用不含EDTA的胰酶分别消化下来，吹散成单个细胞，离心后将上清弃去，PBS清洗3次，70%的预冷乙醇在4℃中固定过夜后送检。
1.2.6FCM检测细胞凋亡。取腺病毒处理48h后的3组细胞离心，PBS重悬于反应缓冲液中，加入5LAnnexinV-PE及10？L的7-ADD，轻轻混匀，避光保存20min，加入200L缓冲液，立即送检。
1.3统计学分析
采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料用“均值±标准差”表示，先进行方差分析，如果存在差异，再用SNK检验进行两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1RT-qPCR检测不同处理组Colo205细胞hepaCAMmRNA的表达
RT-qPCR结果显示：空白对照组（0.02±0.01）及空载组（0.03±0.01）中，Colo205细胞hepaCAMmRNA呈低表达，导入hepaCAM基因后，实验组（1.27±0.09）hepaCAMmRNA水平发生了明显上调（P<0.01），见图1。
**：P<0.01，与空白对照组及空载组比较
图1hepaCAM基因mRNA的含量
Fig.1mRNAexpressionsofhepaCAM
2.2Westernblot检测不同处理组Colo205细胞hepaCAM蛋白的表达
Westernblot结果显示：空白对照组及空载组Colo205细胞hepaCAM蛋白呈低表达，导入hepaCAM基因后，实验组hepaCAM蛋白的表达水平明显增高，见图2。
图2hepaCAM蛋白表达
Fig.2ProteinexpressionsofhepaCAM
2.3MTT检测hepaCAM基因对结肠癌细胞Colo205增殖能力的影响
MTT实验结果显示：实验组Colo205细胞的生存率要显著低于空白对照组及空载组（P<0.01），见图3。
**：P<0.01，与空白对照组及空载组相比
图中实验组第2d、3d、4d和5d的生存率显著低于空白对照组及空载组。
图3MTT检测生存率结果
Fig.3survivalratesinMTTassay
2.4FCM检测hepaCAM基因对结肠癌Colo205细胞周期的影响
FCM结果显示：实验组Colo205细胞G2/M期的值为（35.5±1.82）%，与空白对照组（15.44±0.65）%及空载组（19.51±1.38）%相比，显示出了明显差异（P<0.05），见图4
图4FCM检测细胞周期的结果
Fig.4CellcyclechangestestedbyFCM
2.5FCM检测hepaCAM基因对结肠癌Colo205细胞凋亡的影响
FCM结果显示：实验组Colo205细胞总凋亡率为（14.19±2.63）%，较空白对照组（9.91±2.06）%、空载组（6.45±1.89）%总凋亡率有所增高，但差异未达到统计学意义（P>0.05），见图5。
P空白对照组-实验组=0.054，差异未达到统计学意义
图5：FCM检测细胞凋亡的结果
Fig.5apoptosistestedbyFCM
2讨论
结肠癌是当今社会威胁人类健康的重要疾病之一，目前其发病率位居恶性肿瘤的第三位，确诊后有高达60%的结肠癌患者会发生肿瘤的转移[8]，因此对中晚期结肠癌的治疗一直是一个十分重要而棘手的难题。迄今为止，针对中晚期结肠癌所开展的手术、化疗或放疗等治疗方案都存在无法根治或敏感性较差等不足[1]。基因治疗作为一种新型的治疗方法，可通过阻断癌基因的表达或恢复抑癌基因的功能来抑制肿瘤的发展。鉴于结肠癌的发生是多基因遗传与环境相互作用的结果，基因治疗势必将成为治疗结肠癌的重要手段之一。
hepaCAM基因最初是从人类肝脏中分离出来的一种免疫球蛋白超家族粘附分子，该基因具有抑癌基因的属性，它能显著抑制肿瘤细胞的生长增殖[3]，抑制血管的发生[9、10]，诱导肿瘤细胞凋亡[11]以及产生细胞周期阻滞作用[12]。已有研究表明，hepaCAM基因在多种癌组织及癌细胞株中呈低表达，上调癌细胞中hepaCAM的水平能产生抑制癌细胞生长和增殖，遏制其恶性侵袭行为的作用[4-7]。ShaliS[4]等研究表明：在稳定表达hepaCAM的乳腺癌细胞中，衰老相关基因P53、P21及P27的表达明显上调，运用小干扰RNA敲除P53基因后，hepaCAM对P21的调控失效，因此推测hepaCAM可能是通过P53/P21途径诱导癌细胞发生衰老样生长阻滞。LuoC[12]等进一步研究发现：上调肾癌细胞中hepaCAM的表达可显著促进癌基因c-myc的降解，从而抑制肾癌细胞生长、增殖。 本次研究尝试检测结肠癌细胞株Colo205中hepaCAM基因的表达水平，并探讨其对Colo205细胞增殖与周期的影响。研究发现：hepaCAM基因在结肠癌细胞Colo205中呈现低表达状态，向细胞导入hepaCAM基因后，癌细胞的增殖能力被显著抑制（P<0.01），并出现明显的G2/M期阻滞。但与张巧琳[11]等在肾癌786-0细胞中的研究不同，hepaCAM基因对结肠癌Colo205细胞凋亡的影响尚未到达统计学意义，这可能与不同细胞株对hepaCAM基因调控的应答存在差异有关。
在细胞周期中，G2/M期进程由细胞周期蛋白B1（cyclinB1）与细胞分裂周期基因2（Cdc2）复合物负责调控，若cyclinB1或Cdc2表达下调，细胞将停滞与G2期无法进入M期，从而导致细胞生长停滞。P21、P27蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂，P21可通过与Cyclin-Cdc复合物的相互作用，参与诱导G2/M期阻滞[13]。P21是P53基因的下游分子，后者对G2/M检测点也有重要的调控作用[14]。因此推测，hepaCAM基因可能是通过P53/P21途径下调CyclinB1与Cdc2复合物的含量，从而诱导Colo205发生G2/M阻滞。在结肠癌中hepaCAM与cyclinB1、Cdc2的关系还有待进一步证实。
综上所述：hepaCAM基因在人类结肠癌中表现为一种肿瘤抑制基因，其可显著抑制人类结肠癌Colo205细胞的增殖，并产生周期阻滞作用，这不仅为结肠癌的生长增殖机制进行了补充，对结肠癌的预防、早期诊断、预后判断有重要意义，同时也为结肠癌的基因治疗提供了实验依据、开辟了新的思路。
[1]AoyaqiT，TerracinaKP，RazaA，etal.rcoloncancerperitonealcarcinomatosis[J].WorldJGastroenterol，2014，20（35）：12493-12500.
[2]KanasGP，TaylorA，PrimroseJN，etal.
nmetastaticcolorectalcancer：reviewandmeta-analysisofprognosticfactors[J].ClinEpidemiol.2012，4：283-301.
[3]ChungMohM，HoonLeeL，ShaliS，eta1.
ionofhepaCAM，
anhepatocellularcarcinoma[J].JHepatol，2005，42（6）：833-841.
[4]MohMC，ZhangT，LeeLH，eta1.regulatedincancersandinducessenescencelikegrowtharrestviaap53/p21dependentpathwayinhumanbreastcancercells[J].Carcinogenesis，2008，29（12）：2298-2305.
[5]XunC，LuoC，WuX，eta1.tonproliferationoftumorcellsinrenalcellcarcinoma[J].Urology，2010，75（4）：828-834.
[6]HeY，WuX，LuoC，etal.
geneinbladdercancer[J].BMCCancer，2010，10：83.
[7]TaoJ，LiuQ，WuX，etal.tocytecelladhesionmoleculegenepromoterregioninbladdercarcinoma[J].IntJMedSci.2013，11（13）：1860-7.
[8]SpolveratoG，EjazA，AzadN，etal.ses ：
gprognosis[J].WorldJGastroitestOncol.2013，5（12）：207-21.
[9]YangS，WuX，LuoC，etal.hepaCAMandVEGFinurothelialcarcinoma[J].WorldJUrol，2010，28（4）：473-478.
[10]杨淑哲，罗春丽，吴小候等.HepaCAM基因转染对膀胱癌BIU-87细胞株生长及血管内皮生长因子表达的影响[J].第三军医
关键词：结肠癌;肝细胞黏附分子;抑制率;细胞周期
中国图书分类法分类号：
文献标志码：
收稿日期：
Abstract：Objective：Toinvestigatethebiologicaleffectsofhepa-tocytecelladhesionmolecule
o205.Methods：AfterinfectedwithadenoviruspAdH5-hepaCAMorpAdH5，RT-qPCRandwesternblotwereusedtodetectthemRNAandproteinexpressionsofhepaCAM，MTTassaywasusedtoobservethesurvivalratesofcellsindifferentgroups，FCMwasusedtoanalyzethechangesofcellcycleandapoptosisinColo205.Results：RT-qPCRandwesternblotshowedthatmRNAandproteinlevelsofhepaCAMweredown-regulatedinColo205.AfterinfectedwithadenoviruspAdH5-hepaCAM，theexpressionlevelofhep
-regulateddramatically.MTTassayshowedthatthesurvivalratewasmarkedlydecreased（P<0.01），andInFCMassay，aremarkableG2/MphasearrestwasseeninpAdH5-hepaCAMgroup.Conclusion：AfterintroductionofhepaCAMgene，aremarkablegrowthinhibitionandG2/Mphasearrestcanbeobserved，whichmightbethereasonoftusionbyhepaCAMinhumancoloncarcinomacell.
Keywords：carcinomaofcolon;hepa-tocytecelladhesionmolecule;inhibitionrate;cellcycle
结肠癌是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，近年来，我国结肠癌的发病率有明显增高的趋势。由于结肠癌常起病隐匿，许多患者获得诊断时肿瘤已出现了不同程度的扩散与转移[1，2]。尽管各种治疗决策不断改进，但结肠癌的治疗仍然是一大挑战[1]。基因突变已经被确认为癌症发生的重要标志，因此，开展结肠癌基因治疗研究具有重大意义。ShaliS[3]等研究发现肝细胞黏附分子（hepa-tocytecelladhesionmolecule，hepaCAM）是一种免疫球蛋白类细胞黏附分子，它具有抑制肿瘤生长及增殖的作用。它在乳腺癌、肾癌、膀胱癌等多种肿瘤组织中表达水平明显下降，上调其表达可显示出显著的肿瘤抑制效应[4-7]。而hepaCAM在结肠癌中的研究目前尚存在空白。本研究将检测hepaCAM基因在结肠癌细胞Colo205中的表达水平，并将外源性hepaCAM基因导入Colo205细胞，观察其对肿瘤细胞增殖与周期的影响，为结肠癌的基因治疗探索新的思路。
1材料与方法
1.1材料
腺病毒pAdH5-hepaCAM、空载腺病毒pAdH5及结肠癌细胞系Colo205由本室保存。Trizol、逆转录试剂盒、SYBRGreenⅡ荧光定量PCR试剂盒及DNAmarker购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由Invitrogen公司合成。MTT、胰酶、二甲基亚砜购自Sigma公司。hepaCAM抗体购自LifespanBiosciences公司。β-actin抗体购自SantaCruz公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养及腺病毒感染。待Colo205细胞复苏后，置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。当培养瓶中细胞长至70%时，弃去旧培养液，向培养瓶中加入无血清的RPMI-1640培养液，滴入病毒，放入培养箱培养，半小时后将培养瓶中的培养液轻轻摇匀，继续培养，1.5h后向培养瓶中加入等量的含10%小牛血清的RPMI-1640培养液，感染24h后观察细胞病变（CPE）。将细胞分为3组：实验组（Colo205/pAdH5-hepaCAM组）、空载组（Colo205/pAdH5组）和空白对照组（Colo205组），以备后续实验。
1.2.2实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测hepaCAM基因的mRNA含量。用Trizol提取不同组的总RNA，用逆转录试剂盒将所提RNA逆转录为cDNA，并于-20℃备用。根据hepaCAM、β-actin的序列设计其引物，以β-actin为内参。hepaCAM正义链：5’-TACTGTAGATGTGCCCATTTCG-3’，反义链：5’-CTTCTGGTTTCAGGCGGTC-3’，产物长度461bp;β-actin正义链：5’-ACGAGACCACCTTCAACTCCATC-3’，反义链：5’-TAGAAGCATTTGCGGTGGACGA-3’，产物长度304bp。HepaCAM的PCR扩增条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共40个循环。β-actin的PCR扩增条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共40个循环。 1.2.3Westernblot检测hepaCAM的蛋白表达。各组细胞用预冷的PBS洗3遍，加入预冷的RIPA裂解液，提取细胞总蛋白。测定蛋白浓度后，加入适量蛋白上样缓冲液，煮沸5min后于-80℃保存。SDS-PAGE凝胶电泳时每孔加入等量蛋白，转膜后用5%脱脂奶粉常温下封闭4h，一抗4℃过夜，洗膜后加入生物素标记的二抗，室温孵1h，最后化学发光法显色。
1.2.4MTT检测各组Colo205细胞的增殖能力。将细胞分3组接种于96孔板中，每孔3000个细胞，接种首日细胞贴壁后用腺病毒处理实验组与空载组，导入基因，并将此设为第一个检测点，以后每24h检测一次，共连续检测5d。测定时每孔加入20μlMTT（5mg/ml），继续培养4h后弃去培养液，每孔再加入150μl的DMSO，于摇床上振荡10min，使蓝紫色结晶完全溶解。用酶联免疫检测仪在490nm处检测其吸光度D值，计算出各组的细胞抑制率，计算公式为：生存率（%）=某组某日所测得的平均吸光度D值/该组首日测得的平均吸光度D值×100%。
1.2.5FCM检测细胞周期。向Colo205细胞导入hepaCAM基因，48h后，将各组细胞用不含EDTA的胰酶分别消化下来，吹散成单个细胞，离心后将上清弃去，PBS清洗3次，70%的预冷乙醇在4℃中固定过夜后送检。
1.2.6FCM检测细胞凋亡。取腺病毒处理48h后的3组细胞离心，PBS重悬于反应缓冲液中，加入5LAnnexinV-PE及10？L的7-ADD，轻轻混匀，避光保存20min，加入200L缓冲液，立即送检。
1.3统计学分析
采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料用“均值±标准差”表示，先进行方差分析，如果存在差异，再用SNK检验进行两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1RT-qPCR检测不同处理组Colo205细胞hepaCAMmRNA的表达
RT-qPCR结果显示：空白对照组（0.02±0.01）及空载组（0.03±0.01）中，Colo205细胞hepaCAMmRNA呈低表达，导入hepaCAM基因后，实验组（1.27±0.09）hepaCAMmRNA水平发生了明显上调（P<0.01），见图1。
**：P<0.01，与空白对照组及空载组比较
图1hepaCAM基因mRNA的含量
Fig.1mRNAexpressionsofhepaCAM
2.2Westernblot检测不同处理组Colo205细胞hepaCAM蛋白的表达
Westernblot结果显示：空白对照组及空载组Colo205细胞hepaCAM蛋白呈低表达，导入hepaCAM基因后，实验组hepaCAM蛋白的表达水平明显增高，见图2。
图2hepaCAM蛋白表达
Fig.2ProteinexpressionsofhepaCAM
2.3MTT检测hepaCAM基因对结肠癌细胞Colo205增殖能力的影响
MTT实验结果显示：实验组Colo205细胞的生存率要显著低于空白对照组及空载组（P<0.01），见图3。
**：P<0.01，与空白对照组及空载组相比
图中实验组第2d、3d、4d和5d的生存率显著低于空白对照组及空载组。
图3MTT检测生存率结果
Fig.3survivalratesinMTTassay
2.4FCM检测hepaCAM基因对结肠癌Colo205细胞周期的影响
FCM结果显示：实验组Colo205细胞G2/M期的值为（35.5±1.82）%，与空白对照组（15.44±0.65）%及空载组（19.51±1.38）%相比，显示出了明显差异（P<0.05），见图4
图4FCM检测细胞周期的结果
Fig.4CellcyclechangestestedbyFCM
2.5FCM检测hepaCAM基因对结肠癌Colo205细胞凋亡的影响
FCM结果显示：实验组Colo205细胞总凋亡率为（14.19±2.63）%，较空白对照组（9.91±2.06）%、空载组（6.45±1.89）%总凋亡率有所增高，但差异未达到统计学意义（P>0.05），见图5。
P空白对照组-实验组=0.054，差异未达到统计学意义
图5：FCM检测细胞凋亡的结果
Fig.5apoptosistestedbyFCM
2讨论
结肠癌是当今社会威胁人类健康的重要疾病之一，目前其发病率位居恶性肿瘤的第三位，确诊后有高达60%的结肠癌患者会发生肿瘤的转移[8]，因此对中晚期结肠癌的治疗一直是一个十分重要而棘手的难题。迄今为止，针对中晚期结肠癌所开展的手术、化疗或放疗等治疗方案都存在无法根治或敏感性较差等不足[1]。基因治疗作为一种新型的治疗方法，可通过阻断癌基因的表达或恢复抑癌基因的功能来抑制肿瘤的发展。鉴于结肠癌的发生是多基因遗传与环境相互作用的结果，基因治疗势必将成为治疗结肠癌的重要手段之一。
hepaCAM基因最初是从人类肝脏中分离出来的一种免疫球蛋白超家族粘附分子，该基因具有抑癌基因的属性，它能显著抑制肿瘤细胞的生长增殖[3]，抑制血管的发生[9、10]，诱导肿瘤细胞凋亡[11]以及产生细胞周期阻滞作用[12]。已有研究表明，hepaCAM基因在多种癌组织及癌细胞株中呈低表达，上调癌细胞中hepaCAM的水平能产生抑制癌细胞生长和增殖，遏制其恶性侵袭行为的作用[4-7]。ShaliS[4]等研究表明：在稳定表达hepaCAM的乳腺癌细胞中，衰老相关基因P53、P21及P27的表达明显上调，运用小干扰RNA敲除P53基因后，hepaCAM对P21的调控失效，因此推测hepaCAM可能是通过P53/P21途径诱导癌细胞发生衰老样生长阻滞。LuoC[12]等进一步研究发现：上调肾癌细胞中hepaCAM的表达可显著促进癌基因c-myc的降解，从而抑制肾癌细胞生长、增殖。 本次研究尝试检测结肠癌细胞株Colo205中hepaCAM基因的表达水平，并探讨其对Colo205细胞增殖与周期的影响。研究发现：hepaCAM基因在结肠癌细胞Colo205中呈现低表达状态，向细胞导入hepaCAM基因后，癌细胞的增殖能力被显著抑制（P<0.01），并出现明显的G2/M期阻滞。但与张巧琳[11]等在肾癌786-0细胞中的研究不同，hepaCAM基因对结肠癌Colo205细胞凋亡的影响尚未到达统计学意义，这可能与不同细胞株对hepaCAM基因调控的应答存在差异有关。
在细胞周期中，G2/M期进程由细胞周期蛋白B1（cyclinB1）与细胞分裂周期基因2（Cdc2）复合物负责调控，若cyclinB1或Cdc2表达下调，细胞将停滞与G2期无法进入M期，从而导致细胞生长停滞。P21、P27蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂，P21可通过与Cyclin-Cdc复合物的相互作用，参与诱导G2/M期阻滞[13]。P21是P53基因的下游分子，后者对G2/M检测点也有重要的调控作用[14]。因此推测，hepaCAM基因可能是通过P53/P21途径下调CyclinB1与Cdc2复合物的含量，从而诱导Colo205发生G2/M阻滞。在结肠癌中hepaCAM与cyclinB1、Cdc2的关系还有待进一步证实。
综上所述：hepaCAM基因在人类结肠癌中表现为一种肿瘤抑制基因，其可显著抑制人类结肠癌Colo205细胞的增殖，并产生周期阻滞作用，这不仅为结肠癌的生长增殖机制进行了补充，对结肠癌的预防、早期诊断、预后判断有重要意义，同时也为结肠癌的基因治疗提供了实验依据、开辟了新的思路。
[1]AoyaqiT，TerracinaKP，RazaA，etal.rcoloncancerperitonealcarcinomatosis[J].WorldJGastroenterol，2014，20（35）：12493-12500.
[2]KanasGP，TaylorA，PrimroseJN，etal.
nmetastaticcolorectalcancer：reviewandmeta-analysisofprognosticfactors[J].ClinEpidemiol.2012，4：283-301.
[3]ChungMohM，HoonLeeL，ShaliS，eta1.
ionofhepaCAM，
anhepatocellularcarcinoma[J].JHepatol，2005，42（6）：833-841.
[4]MohMC，ZhangT，LeeLH，eta1.regulatedincancersandinducessenescencelikegrowtharrestviaap53/p21dependentpathwayinhumanbreastcancercells[J].Carcinogenesis，2008，29（12）：2298-2305.
[5]XunC，LuoC，WuX，eta1.tonproliferationoftumorcellsinrenalcellcarcinoma[J].Urology，2010，75（4）：828-834.
[6]HeY，WuX，LuoC，etal.
geneinbladdercancer[J].BMCCancer，2010，10：83.
[7]TaoJ，LiuQ，WuX，etal.tocytecelladhesionmoleculegenepromoterregioninbladdercarcinoma[J].IntJMedSci.2013，11（13）：1860-7.
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