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摘 要:目的:研究PTEN、P16、Rhoc基因表达与骨肉瘤的关系。方法:选取20例骨肉瘤患者和20例骨软骨瘤患者,用免疫组化SP法检测PTEN蛋白的表达;RT-PCR法检测P16、Rhoc mRNA的表达。结果:PTEN蛋白和P16 mRNA在骨软骨瘤中的表达分别为123.00±9.26和0.80±0.02,显著高于骨肉瘤中的57.75±8.30和0.36±0.11(P<0.05);Rhoc mRNA在骨肉瘤中的表达为0.93±0.04,高于骨软骨瘤中的0.54±0.05(P<0.05)。结论:PTEN、P16、Rhoc与骨肉瘤的发生、发展以及侵袭、转移有关,且三者具有相关性。临床上联合检测PTEN、P16、Rhoc的表达对骨肉瘤的早期诊断、预后判断具有指导意义。
关键词:骨肉瘤;PTEN;P16;Rhoc
中图分类号:R730.231+3文献标识码:A文章编号:1673-2197(2009)06-0018-02
骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤,好发于青少年,恶性程度高,预后差,是严重影响青壮年健康的恶性肿瘤。传统治疗方法如手术切除、截肢加辅助化疗,创伤大,存活率低。其病因和发病机制迄今尚不清楚,因此,在基因水平上了解骨肉瘤的发生、发展,对于更好地选择治疗方法具有重要意义。我们运用免疫组化法和RT-PCR法,检测骨肉瘤中PTEN、P16、Rhoc的表达水平,探讨其在骨肉瘤发生发展中的作用机制,以期为骨肉瘤的临床诊断和治疗提供参考。
1 资料与方法
1.1 研究对象
骨肉瘤标本分别来自20例骨肉瘤手术治疗患者,其中男13例,女7例;年龄10-50岁,平均27.1岁。根据WHO骨肉瘤分类标准,一般型10例,成软骨型2例,成纤维型1例,血管扩张型3例,髓内高分化型1例,恶性纤维组织细胞瘤型1例,骨旁骨肉瘤1例,小细胞型1例;组织学分级:高分化(Ⅰ～Ⅱ级)14例,低分化(Ⅲ级)6例。以同期收检的20例骨软骨瘤手术切除标本作为对照。标本于手术切下后分别置于液氮中保存;甲醛固定,常规石蜡包埋,3μm连续切片。
1.2 检测试剂及方法
采用免疫组化SP法。鼠抗人PTEN单克隆抗体及SP试剂盒均购自北京博奥森生物技术公司。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。用已知阳性切片作为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。每例均随机观察8个高倍视野,读取阳性细胞数。
Trizol试剂购自美国invitrogen公司;RT-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。根据登录GenBank中检索人P16、RhoC基因已知序列,应用Priemer5.0软件设计引物碱基对序列,由宝生物工程(大连)有限公司合成。总RNA提取及逆转录和PCR各操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。
1.3 统计学处理
用SPSS11.0软件进行数据分析,指标测定结果计量资料以x±s表示,采用t检验。P<0.05为组间差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PTEN在骨肉瘤及骨软骨瘤中的表达
PTEN阳性染色主要定位于肿瘤细胞胞浆,亦为棕黄色颗粒。结果见表1。
2.2 P16、RhoC mRNA的表达结果
骨肉瘤组P16产物电泳条带暗、产量低,RhoC产物条带强、产量高。结果见表2。
3 讨论
P16是一种新型抑癌基因,位于人类染色体9P16区,与细胞周期调节密切相关,该蛋白是CDK4的抑制因子,通过与细胞周期蛋白D1以竞争方式结合CDK4,抑制CDK4的活性,使细胞停滞于G0期和G1期,抑制细胞分裂增殖。CDK4可能通过调节多种底物的磷酸化,是G1-S期和G2-M期转换的关键。体外研究证实,P16蛋白能特异地抑制CDK4的活性。细胞周期蛋白D表现某种癌基因的作用,当其过度表达时,细胞便会向癌变发展。细胞周期蛋白D同CDK4结合时,可刺激细胞生长分裂;P16与CDK4结合时,致使其磷酸化活性降低,引起Rb磷酸化而导致肿瘤细胞死亡[1,2]。可见P16既是细胞周期固有的调控者,又是抑制肿瘤生长的关键成分。
PTEN基因位于人类10q23,是近年来发现的具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因,其活性的改变与多种肿瘤的发生有着密切的关系。PTEN基因编码的蛋白具有磷酸酯酶的特征和作用,可负向调节PI3K/Akt信号通路,对抗PI3K途径转导的生长和生存信号,抑制肿瘤的发生和发展。刘伟等[3]对43例非小细胞肺癌组织和20例癌旁正常肺组织PTEN表达情况的研究显示,PTEN在肺癌组织中的表达率为46.5%,而在癌旁组织中的表达率为95.0%,两组间比较有显著性差异。Levine等[4]报道,在犬的骨肉瘤细胞系和骨肉瘤组织中都可看见PTEN蛋白表达下降。
影响肿瘤细胞侵袭性的因素有很多,其中肿瘤细胞的运动能力是关键因素之一。许多实验均提示:肿瘤细胞的运动能力与侵袭性之间有密切关系[5],高侵袭转移的肿瘤细胞往往具有较强的运动能力。肿瘤细胞运动的关键蛋白是激动蛋白,而RhoC又是调控激动蛋白的关键基因。
本研究发现,骨软骨瘤中PTEN蛋白和P16 mRNA的表达显著高于骨肉瘤;而骨肉瘤中的Rhoc mRNA表达则明显高于骨软骨瘤。这说明p16和PTEN表达减低有可能使癌细胞获得某种生长优势,预示这些患者预后不良;而Rhoc表达增强说明骨肉瘤细胞侵袭运动能力增加。
综上所述,PTEN、P16、Rhoc与骨肉瘤的发生、发展以及侵袭、转移有关,且三者具有协同性。深入研究PTEN、P16、Rhoc的协同作用,将对骨肉瘤的预防、临床治疗及预后的判断具有重要意义。
参考文献:
[1] 高嵩,赵炬才,张广泉.人骨肉瘤组织PTEN蛋白的表达及临床意义[J].实用诊断与治疗杂志,2005,19(2):933.
[2] LUKAS J,PARRY D,AAGAARD L,et al. Retinoblastoma-protem-dependent cell-cycle inhibition by the tumour suppressor p16[J]. Nature,1995,375(6531):503-506.
[3] 刘伟,于文成,时衍同,等.PTEN在非小细胞肺癌中的表达及其意义[J].齐鲁医学杂志,2005,20(3):217-221.
[4] LEVINE RA,FOREST T,SMITH C.Tumor suppressor PTEN is mutated in canine osteosarcoma cell lines and tumors[J]. Vet Pathol,2002(39):372-378.
[5] LIU B,KOTENBERG SA,MIRKIN MV.Scanning electrochemical microscopy of living cells:different redox activities of nonmetastatic and metastatic human breast cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(18):9855-9860.
(责任编辑:曾楚华)
关键词:骨肉瘤;PTEN;P16;Rhoc
中图分类号:R730.231+3文献标识码:A文章编号:1673-2197(2009)06-0018-02
骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤,好发于青少年,恶性程度高,预后差,是严重影响青壮年健康的恶性肿瘤。传统治疗方法如手术切除、截肢加辅助化疗,创伤大,存活率低。其病因和发病机制迄今尚不清楚,因此,在基因水平上了解骨肉瘤的发生、发展,对于更好地选择治疗方法具有重要意义。我们运用免疫组化法和RT-PCR法,检测骨肉瘤中PTEN、P16、Rhoc的表达水平,探讨其在骨肉瘤发生发展中的作用机制,以期为骨肉瘤的临床诊断和治疗提供参考。
1 资料与方法
1.1 研究对象
骨肉瘤标本分别来自20例骨肉瘤手术治疗患者,其中男13例,女7例;年龄10-50岁,平均27.1岁。根据WHO骨肉瘤分类标准,一般型10例,成软骨型2例,成纤维型1例,血管扩张型3例,髓内高分化型1例,恶性纤维组织细胞瘤型1例,骨旁骨肉瘤1例,小细胞型1例;组织学分级:高分化(Ⅰ～Ⅱ级)14例,低分化(Ⅲ级)6例。以同期收检的20例骨软骨瘤手术切除标本作为对照。标本于手术切下后分别置于液氮中保存;甲醛固定,常规石蜡包埋,3μm连续切片。
1.2 检测试剂及方法
采用免疫组化SP法。鼠抗人PTEN单克隆抗体及SP试剂盒均购自北京博奥森生物技术公司。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。用已知阳性切片作为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。每例均随机观察8个高倍视野,读取阳性细胞数。
Trizol试剂购自美国invitrogen公司;RT-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。根据登录GenBank中检索人P16、RhoC基因已知序列,应用Priemer5.0软件设计引物碱基对序列,由宝生物工程(大连)有限公司合成。总RNA提取及逆转录和PCR各操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。
1.3 统计学处理
用SPSS11.0软件进行数据分析,指标测定结果计量资料以x±s表示,采用t检验。P<0.05为组间差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PTEN在骨肉瘤及骨软骨瘤中的表达
PTEN阳性染色主要定位于肿瘤细胞胞浆,亦为棕黄色颗粒。结果见表1。
2.2 P16、RhoC mRNA的表达结果
骨肉瘤组P16产物电泳条带暗、产量低,RhoC产物条带强、产量高。结果见表2。
3 讨论
P16是一种新型抑癌基因,位于人类染色体9P16区,与细胞周期调节密切相关,该蛋白是CDK4的抑制因子,通过与细胞周期蛋白D1以竞争方式结合CDK4,抑制CDK4的活性,使细胞停滞于G0期和G1期,抑制细胞分裂增殖。CDK4可能通过调节多种底物的磷酸化,是G1-S期和G2-M期转换的关键。体外研究证实,P16蛋白能特异地抑制CDK4的活性。细胞周期蛋白D表现某种癌基因的作用,当其过度表达时,细胞便会向癌变发展。细胞周期蛋白D同CDK4结合时,可刺激细胞生长分裂;P16与CDK4结合时,致使其磷酸化活性降低,引起Rb磷酸化而导致肿瘤细胞死亡[1,2]。可见P16既是细胞周期固有的调控者,又是抑制肿瘤生长的关键成分。
PTEN基因位于人类10q23,是近年来发现的具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因,其活性的改变与多种肿瘤的发生有着密切的关系。PTEN基因编码的蛋白具有磷酸酯酶的特征和作用,可负向调节PI3K/Akt信号通路,对抗PI3K途径转导的生长和生存信号,抑制肿瘤的发生和发展。刘伟等[3]对43例非小细胞肺癌组织和20例癌旁正常肺组织PTEN表达情况的研究显示,PTEN在肺癌组织中的表达率为46.5%,而在癌旁组织中的表达率为95.0%,两组间比较有显著性差异。Levine等[4]报道,在犬的骨肉瘤细胞系和骨肉瘤组织中都可看见PTEN蛋白表达下降。
影响肿瘤细胞侵袭性的因素有很多,其中肿瘤细胞的运动能力是关键因素之一。许多实验均提示:肿瘤细胞的运动能力与侵袭性之间有密切关系[5],高侵袭转移的肿瘤细胞往往具有较强的运动能力。肿瘤细胞运动的关键蛋白是激动蛋白,而RhoC又是调控激动蛋白的关键基因。
本研究发现,骨软骨瘤中PTEN蛋白和P16 mRNA的表达显著高于骨肉瘤;而骨肉瘤中的Rhoc mRNA表达则明显高于骨软骨瘤。这说明p16和PTEN表达减低有可能使癌细胞获得某种生长优势,预示这些患者预后不良;而Rhoc表达增强说明骨肉瘤细胞侵袭运动能力增加。
综上所述,PTEN、P16、Rhoc与骨肉瘤的发生、发展以及侵袭、转移有关,且三者具有协同性。深入研究PTEN、P16、Rhoc的协同作用,将对骨肉瘤的预防、临床治疗及预后的判断具有重要意义。
参考文献:
[1] 高嵩,赵炬才,张广泉.人骨肉瘤组织PTEN蛋白的表达及临床意义[J].实用诊断与治疗杂志,2005,19(2):933.
[2] LUKAS J,PARRY D,AAGAARD L,et al. Retinoblastoma-protem-dependent cell-cycle inhibition by the tumour suppressor p16[J]. Nature,1995,375(6531):503-506.
[3] 刘伟,于文成,时衍同,等.PTEN在非小细胞肺癌中的表达及其意义[J].齐鲁医学杂志,2005,20(3):217-221.
[4] LEVINE RA,FOREST T,SMITH C.Tumor suppressor PTEN is mutated in canine osteosarcoma cell lines and tumors[J]. Vet Pathol,2002(39):372-378.
[5] LIU B,KOTENBERG SA,MIRKIN MV.Scanning electrochemical microscopy of living cells:different redox activities of nonmetastatic and metastatic human breast cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(18):9855-9860.
(责任编辑:曾楚华)