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[摘要]目的研究在脾细胞抗髓母细胞瘤的免疫过程中，IL-17所起的免疫调节功能。方法将小鼠脾脏取得的脾淋巴细胞在不同浓度的IL-17下与髓母细胞瘤Daoy细胞株共培养，以Daoy细胞株单独培养组作为对照，用二苯基溴化四氮唑蓝法测定细胞毒性效应。结果实验结果发现各组Daoy细胞株和脾细胞共培养组在不同浓度IL-17（20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL）条件下细胞抑制率有统计学意义（P<0.01），且IL-17在一定浓度范围内（20～80ng/mL），IL-17浓度越高，髓母细胞瘤的细胞生长抑制率越大。此外且随着时间的增加，各组肿瘤细胞的生长抑制率也均有增加。结论IL-17在一定浓度范围内能增加小鼠脾细胞对髓母细胞瘤Daoy细胞株的生长抑制作用，且在一定时间段内，随着时间的增加，各组肿瘤细胞的生长抑制率也均有增加。
[关键词]髓母细胞瘤；IL-17；Th17细胞；MTT法；细胞生长抑制率
[中图分类号]R739.41 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）05-30-04
髓母细胞瘤是儿童最常见的原发性恶性肿瘤之一，恶性程度高，不但手术后容易复发，还可沿蛛网膜下腔转移到脑脊髓和脑室各处，治疗困难，在恶性肿瘤的治疗新方法的探索中，目前肿瘤的免疫治疗也越来越被重视，本研究探讨在脾细胞抗髓母细胞瘤的免疫中，IL-17所起的免疫调节功能。
1材料与方法
1.1一般材料
细胞株：髓母细胞瘤Daoy细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所；采用含10%胎牛血清FBS（上海启凡生物科技有限公司，货号：1099141）、105U/L青霉素、100mg/L链霉素（上海启凡生物科技有限公司，货号：15140122）的MEM培养液（GIBCO公司，货号：11095-072），置于37℃、5%CO2培养箱（Thermo公司，型号：3111）内培养进行培养，取对数生长期细胞进行试验。
1.2小鼠脾淋巴细胞制备
Balb/c雄性小鼠由复旦大学医学院神经生物国家重点实验室提供，取12只6周龄的小鼠，通过脱颈椎处死，在无菌条件下手术取脾，用Hanks液洗涤1次后，置于200目金属网上进行研压碾磨过滤，收集网下脾细胞悬液。滤过的脾细胞以1000r/min离心5min，弃上清液，加红细胞裂解液溶解红细胞，反复洗涤后，重悬于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液（GIBCO公司，货号：31800-022），调整细胞浓度为1×107/mL。加入ConA至3mg/mL，置于37℃，5%CO：培养箱中培养。
1.3 MTT法进行体外细胞杀伤活性实验
实验组以1×105/mL髓母细胞瘤Daoy细胞株为靶细胞，1×106/mL小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞，混合后接种到96孔板，每组4个复孔，除对照组外，各组共培养液加入不同浓度的IL-17（ProSpec公司，货号：CYT-640）；以未加入脾淋巴细胞的单纯髓母细胞瘤Daoy细胞株为对照组。各组均置于37℃，5%CO2孵箱内共培养，分别在24h、48h、72h后，加入5mg/mL的MTT溶液（Duchefa公司，货号：P215600）20μL，37℃继续培养4h后弃上清终止培养；每孔加入DMSO 200μL，37℃振荡10min，在酶标仪（Thermo公司，型号：Multiskan FC）490am处测各孔光吸收度（OD），计算各组细胞的杀伤率。杀伤率=[（对照组平均0D490值一实验组平均OD490值）/对照组平均OD490值]×100%。结果见表1。
1.4统计学处理
采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析及S-N-K法检验。所有的变量均以（x±s）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 IL-17可增加脾淋巴细胞对髓母细胞瘤Daoy细胞株的生长抑制作用
髓母细胞瘤Daoy细胞株和小鼠脾淋巴细胞进行共培养，用MTT法测定未加入IL-17和加入不同浓度的IL-17的各组的体外细胞杀伤活性。实验分别对24h、48h和72h各组生长抑制率用SPSS16.0软件进行单因素反差分析，结果见表1和图1：显示不同浓度IL-17组的细胞抑制率有显著统计学差异（24h，F=1327，P<0.01；48h，F=2198，P<0.01：72h，F=1290，P<0.01）。进一步进行S-N-K法检验，发现Daoy细胞株+脾细胞+不同浓度IL-17（20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL）各组的细胞抑制率有统计学差异（注：S-N-K法检验SPSS16.0软件仅在无统计学意义组显示P值）。且IL-17在20～80ng/mL范围内，髓母细胞瘤的细胞生长抑制率越随着IL-17浓度的增高而增加（表1，图1）。
2.2 IL-17对脾淋巴细胞的促进作用与时间成正比
对各时间点的Daoy细胞株生长抑制率进行单因素反差分析及S-N-K法检验，发现各组在不同共培养时间的生长抑制率有统计学差异（根据IL-17浓度分组：0ng/mL，F=947，P<0.01；20ng/mL，F=67，P<0.01；40ng/mL，F=273，P<0.01；60ng/mL，F=79，P<0.01；80ng/mL，F=11，P<0.01；100ng/mL，F=18，P<0.01），并且实验发现脾细胞对肿瘤细胞的生长抑制作用随着时间的增加而增加，结果有统计学意义，见表1。
3讨论
髓母细胞瘤是儿童最常见的原发性恶性肿瘤之一，恶性程度高，由Bialy和Cushing首先发现并命名。髓母细胞瘤不但手术后容易复发，还可沿蛛网膜下腔转移到脑脊髓和脑室各处，治疗困难，是现代神经外科的治疗难题之一。此外髓母细胞瘤多位于四脑室内，容易与脑干粘连，导致手术全切困难。并且手术后患儿多需要进行化疗和全脑脊髓放疗，但儿童对放、化疗的耐受差，并且放、化疗还会影响儿童的生长发育，因此有必要寻找新的治疗方法治疗髓母细胞瘤。在髓母细胞瘤的治疗新方法的探索中，目前肿瘤的免疫治疗也越来越被重视。 Th17细胞的概念在近年来被提出，是近来发现的一类CD4*T细胞，因为这一类T细胞亚群以产生白介素IL-17（Interleukin-17）为特点，被命名为Th17细胞（也叫辅助性T细胞17亚群或产生IL-17的T辅助细胞，T helper17cell or IL-17-producing T helper，Th17），Th17细胞产生的最重要的效应因子是IL-17，IL-17具有强烈促炎症作用，其受体在体内表达广泛。
IL-17能够刺激上皮细胞、内皮细胞或成纤维细胞产生白介素IL-6、IL-8、INF-gamma、G-CSF等细胞因子，这些细胞因子的作用还可有助于CD8+T细胞和DC细胞趋化积聚，引起局部组织淋巴细胞浸润和肿瘤组织破坏。目前已有研究发现Th17细胞与IL-17与前列腺癌、髓母细胞瘤、卵巢癌等肿瘤均有一定在关系。
四唑盐（MTT）比色试验是一种检测细胞存活和生长的常用方法。本实验采用MTT法检测了与脾淋巴细胞共培养的髓母细胞瘤Daoy细胞株的生长抑制情况，发现IL-17（20～100ng/mL），可增加脾淋巴细胞对共培养肿瘤细胞的生长抑制作用；并且在一定时间范围内（24～72h），随着时间的延长，Daoy细胞株的生长抑制率也增加。并且我们发现在一定浓度范围内（20～80ng/mL），随着IL-17的浓度增加，脾淋巴细胞对髓母细胞瘤Daoy细胞株的生长抑制作用也增强。
近年来在研究发现Th17细胞在抗肿瘤免疫中也起了重要的作用。甚至Th17与部分肿瘤疾病临床预后相关，可能成为某些肿瘤治疗的筛选指标和疗效及预后的预测因子。在黑素瘤和纤维肉瘤中发现Th17细胞具有增强抗肿瘤免疫的功能。Th17细胞可加强肿瘤组织中的炎症反应，增强CD8+细胞毒性T细胞和DC细胞在肿瘤中的浸润，激活肿瘤组织特异的CD8+细胞毒性T细胞发挥抗肿瘤功能。
而IL-17是Th17细胞在主要效应因子，Th17细胞通过IL-17发挥其免疫调节作用。有研究发现在IL-17缺陷的小鼠更易发生肺黑色素瘤，用分泌IL-17的T细胞治疗可有效减小肿瘤的发生几率。更重要的是，在IL-17的辅助下，Th17细胞表现出比Th1细胞更强的治疗功效，使用Th17细胞治疗可有效激活肿瘤特异性的CD8*T细胞。Th17细胞还能召集树突状细胞聚集到肿瘤组织中。本实验发现IL-17在髓母细胞瘤在抗肿瘤免疫中也起了一定在作用，其中在作用机制还有待于我们在今后的工作中进一步探索。
在一定浓度范围内（20～80ng/mL），IL-17可增加脾淋巴细胞对髓母细胞瘤Daoy细胞株的生长抑制作用，并且在一定时间范围内（24～72h），随着时间的延长，脾淋巴细胞对Daoy细胞株的生长抑制率也增加。
[关键词]髓母细胞瘤；IL-17；Th17细胞；MTT法；细胞生长抑制率
[中图分类号]R739.41 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）05-30-04
髓母细胞瘤是儿童最常见的原发性恶性肿瘤之一，恶性程度高，不但手术后容易复发，还可沿蛛网膜下腔转移到脑脊髓和脑室各处，治疗困难，在恶性肿瘤的治疗新方法的探索中，目前肿瘤的免疫治疗也越来越被重视，本研究探讨在脾细胞抗髓母细胞瘤的免疫中，IL-17所起的免疫调节功能。
1材料与方法
1.1一般材料
细胞株：髓母细胞瘤Daoy细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所；采用含10%胎牛血清FBS（上海启凡生物科技有限公司，货号：1099141）、105U/L青霉素、100mg/L链霉素（上海启凡生物科技有限公司，货号：15140122）的MEM培养液（GIBCO公司，货号：11095-072），置于37℃、5%CO2培养箱（Thermo公司，型号：3111）内培养进行培养，取对数生长期细胞进行试验。
1.2小鼠脾淋巴细胞制备
Balb/c雄性小鼠由复旦大学医学院神经生物国家重点实验室提供，取12只6周龄的小鼠，通过脱颈椎处死，在无菌条件下手术取脾，用Hanks液洗涤1次后，置于200目金属网上进行研压碾磨过滤，收集网下脾细胞悬液。滤过的脾细胞以1000r/min离心5min，弃上清液，加红细胞裂解液溶解红细胞，反复洗涤后，重悬于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液（GIBCO公司，货号：31800-022），调整细胞浓度为1×107/mL。加入ConA至3mg/mL，置于37℃，5%CO：培养箱中培养。
1.3 MTT法进行体外细胞杀伤活性实验
实验组以1×105/mL髓母细胞瘤Daoy细胞株为靶细胞，1×106/mL小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞，混合后接种到96孔板，每组4个复孔，除对照组外，各组共培养液加入不同浓度的IL-17（ProSpec公司，货号：CYT-640）；以未加入脾淋巴细胞的单纯髓母细胞瘤Daoy细胞株为对照组。各组均置于37℃，5%CO2孵箱内共培养，分别在24h、48h、72h后，加入5mg/mL的MTT溶液（Duchefa公司，货号：P215600）20μL，37℃继续培养4h后弃上清终止培养；每孔加入DMSO 200μL，37℃振荡10min，在酶标仪（Thermo公司，型号：Multiskan FC）490am处测各孔光吸收度（OD），计算各组细胞的杀伤率。杀伤率=[（对照组平均0D490值一实验组平均OD490值）/对照组平均OD490值]×100%。结果见表1。
1.4统计学处理
采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析及S-N-K法检验。所有的变量均以（x±s）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 IL-17可增加脾淋巴细胞对髓母细胞瘤Daoy细胞株的生长抑制作用
髓母细胞瘤Daoy细胞株和小鼠脾淋巴细胞进行共培养，用MTT法测定未加入IL-17和加入不同浓度的IL-17的各组的体外细胞杀伤活性。实验分别对24h、48h和72h各组生长抑制率用SPSS16.0软件进行单因素反差分析，结果见表1和图1：显示不同浓度IL-17组的细胞抑制率有显著统计学差异（24h，F=1327，P<0.01；48h，F=2198，P<0.01：72h，F=1290，P<0.01）。进一步进行S-N-K法检验，发现Daoy细胞株+脾细胞+不同浓度IL-17（20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL）各组的细胞抑制率有统计学差异（注：S-N-K法检验SPSS16.0软件仅在无统计学意义组显示P值）。且IL-17在20～80ng/mL范围内，髓母细胞瘤的细胞生长抑制率越随着IL-17浓度的增高而增加（表1，图1）。
2.2 IL-17对脾淋巴细胞的促进作用与时间成正比
对各时间点的Daoy细胞株生长抑制率进行单因素反差分析及S-N-K法检验，发现各组在不同共培养时间的生长抑制率有统计学差异（根据IL-17浓度分组：0ng/mL，F=947，P<0.01；20ng/mL，F=67，P<0.01；40ng/mL，F=273，P<0.01；60ng/mL，F=79，P<0.01；80ng/mL，F=11，P<0.01；100ng/mL，F=18，P<0.01），并且实验发现脾细胞对肿瘤细胞的生长抑制作用随着时间的增加而增加，结果有统计学意义，见表1。
3讨论
髓母细胞瘤是儿童最常见的原发性恶性肿瘤之一，恶性程度高，由Bialy和Cushing首先发现并命名。髓母细胞瘤不但手术后容易复发，还可沿蛛网膜下腔转移到脑脊髓和脑室各处，治疗困难，是现代神经外科的治疗难题之一。此外髓母细胞瘤多位于四脑室内，容易与脑干粘连，导致手术全切困难。并且手术后患儿多需要进行化疗和全脑脊髓放疗，但儿童对放、化疗的耐受差，并且放、化疗还会影响儿童的生长发育，因此有必要寻找新的治疗方法治疗髓母细胞瘤。在髓母细胞瘤的治疗新方法的探索中，目前肿瘤的免疫治疗也越来越被重视。 Th17细胞的概念在近年来被提出，是近来发现的一类CD4*T细胞，因为这一类T细胞亚群以产生白介素IL-17（Interleukin-17）为特点，被命名为Th17细胞（也叫辅助性T细胞17亚群或产生IL-17的T辅助细胞，T helper17cell or IL-17-producing T helper，Th17），Th17细胞产生的最重要的效应因子是IL-17，IL-17具有强烈促炎症作用，其受体在体内表达广泛。
IL-17能够刺激上皮细胞、内皮细胞或成纤维细胞产生白介素IL-6、IL-8、INF-gamma、G-CSF等细胞因子，这些细胞因子的作用还可有助于CD8+T细胞和DC细胞趋化积聚，引起局部组织淋巴细胞浸润和肿瘤组织破坏。目前已有研究发现Th17细胞与IL-17与前列腺癌、髓母细胞瘤、卵巢癌等肿瘤均有一定在关系。
四唑盐（MTT）比色试验是一种检测细胞存活和生长的常用方法。本实验采用MTT法检测了与脾淋巴细胞共培养的髓母细胞瘤Daoy细胞株的生长抑制情况，发现IL-17（20～100ng/mL），可增加脾淋巴细胞对共培养肿瘤细胞的生长抑制作用；并且在一定时间范围内（24～72h），随着时间的延长，Daoy细胞株的生长抑制率也增加。并且我们发现在一定浓度范围内（20～80ng/mL），随着IL-17的浓度增加，脾淋巴细胞对髓母细胞瘤Daoy细胞株的生长抑制作用也增强。
近年来在研究发现Th17细胞在抗肿瘤免疫中也起了重要的作用。甚至Th17与部分肿瘤疾病临床预后相关，可能成为某些肿瘤治疗的筛选指标和疗效及预后的预测因子。在黑素瘤和纤维肉瘤中发现Th17细胞具有增强抗肿瘤免疫的功能。Th17细胞可加强肿瘤组织中的炎症反应，增强CD8+细胞毒性T细胞和DC细胞在肿瘤中的浸润，激活肿瘤组织特异的CD8+细胞毒性T细胞发挥抗肿瘤功能。
而IL-17是Th17细胞在主要效应因子，Th17细胞通过IL-17发挥其免疫调节作用。有研究发现在IL-17缺陷的小鼠更易发生肺黑色素瘤，用分泌IL-17的T细胞治疗可有效减小肿瘤的发生几率。更重要的是，在IL-17的辅助下，Th17细胞表现出比Th1细胞更强的治疗功效，使用Th17细胞治疗可有效激活肿瘤特异性的CD8*T细胞。Th17细胞还能召集树突状细胞聚集到肿瘤组织中。本实验发现IL-17在髓母细胞瘤在抗肿瘤免疫中也起了一定在作用，其中在作用机制还有待于我们在今后的工作中进一步探索。
在一定浓度范围内（20～80ng/mL），IL-17可增加脾淋巴细胞对髓母细胞瘤Daoy细胞株的生长抑制作用，并且在一定时间范围内（24～72h），随着时间的延长，脾淋巴细胞对Daoy细胞株的生长抑制率也增加。