建立液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法同时测定人血浆中伊伐布雷定和N-去甲基伊伐布雷定,并考察稳定同位素内标d3-伊伐布雷定对待测物测定的影响。血浆样品经乙腈沉淀蛋白处理后,经Capcell PAK C18柱(100 mm×4.6 mm,5μm)分离,以甲醇-5 mmol·L-1醋酸铵溶液为流动相。采用电喷雾电离源(ESI源),多反应监测模式进行正离子检测。实验中考察了伊伐布雷定同位素峰[M+H+3]+对内标峰面积的影响以及内标的同位素纯度对伊伐布雷定测定的干扰,通过选择合适的内标浓度满足了方法选择性和线性范围的要求。方法验证结果表明,测定伊伐布雷定和N-去甲基伊伐布雷定线性范围分别为0.100~60.0 ng·m L-1和0.050 0~20.0ng·m L-1。各待测物的日内、日间精密度以及准确度均符合生物样品分析相关要求。本方法成功应用于硫酸氢伊伐布雷定缓释片的人体药动学研究。