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摘 要 采用铁皮石斛试管苗，以组培室常用光照强度条件光强范围内，叶片SPAD值与单苗茎粗、总根尖数及叶片蔗糖合成酶活性呈显著的正相关。因此，生产铁皮石斛优质种苗的适宜组培光照强度大小为75 μmol/（m2·s），叶片SPAD值可能是衡量铁皮石斛幼苗素质的一项关键指标。
关键词 铁皮石斛；试管苗；根系性状；蔗糖合成酶；超氧化物歧化酶
中图分类号 S567 文献标识码 A
Effect of Light Intensity on Seedling Growth and
Physiological Characteristics of Dendrobium
officinale Kimura et Migo in vitro
LI Wu1，2， ZHENG Jingrong1，2， MO Zhaowen3， LI Zhijun1，2， JIANG Li2
QIU Daoshou1， CHAI Shike1， LIU Xiaojin1，2*
1 Crops Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640， China
2 Guangdong Golden Crops Agriculture Science & Technology Company， Guangzhou， Guangdong 510640， China
3 College of Agriculture， South China Agriculture University， Guangzhou， Guangdong 510642， China
Abstact The suitable light intensity has a great significance for cultivating high quality Dendrobium officinale seedlings in vitro. In the study， we used test-tube seedlings as the experimental material， and set four higher light intensity， T0（25 μmol/（m2·s）， T1（50 μmol/（m2·s）， T2（75 μmol/（m2·s）， T3（100 μmol/（m2·s）. T0 as the control was traditional light intersity level in tissue culture lab. We studied the effect of other treatments with higher light intensity on seedling growth and physiological characteristics. The results showed that， compared with T0， T2 increased significantly stem diameter per plant and fresh weight per plant under the premise of no significant influence on both green leaf number per plant and seedling number per bottle， respectively， also significantly increased the average diameter， root volume per plant and tips per plant， and coordinated the development of plant root traits and upper morphological characters， also significantly increased the SPAD value and SS activities of leaves. Correlation analysis also showed that， in a certain range of light intensity from 25 to 100 μmol/（m2·s）， the correlation of stem diameter per plant， tips per plant， leaf SS activity， and leaf SPAD value was significantly positive， respectively. So the appropriate light intensity level for the production of high quality tissue culture seedling of D. officinale was 75 μmol/（m2·s）. Besides， leaf SPAD value could be a key indicator of the seedling quality in D. officinale.
Key words Dendrobium officinale； Test-tube seedlings； Root traits； Sucrose synthase（SS）； Superoxide dismutase（SOD）
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.020
铁皮石斛（Dendrobium Officinale Kimura et Migo）是我国传统名贵中药，其主效成分包括特有的多糖[1-3]、生物碱[4]、菲类化合物[4]，以及除色氨酸以外的所有人体必需氨基酸和微量元素[5]等，具有增强免疫力[6-9]、抗肿瘤[10-11]、降血糖[12-13]、抗氧化[11，14-17]等药理作用，在治疗胃肠道疾病、白内障、关节炎、血栓闭塞性脉管炎及慢性咽炎等疾病有很好的临床疗效[18]。近年来，野生资源因人为的过度采挖及其生境的严重破坏已濒临灭绝，而铁皮石斛因种子极小、无胚乳，在自然条件下需与真菌共生才能萌发，其实生苗很难满足日益增长的人工栽培用种需要。目前，利用组织培养技术快速繁殖试管苗是解决铁皮石斛种苗需求的有效途径，相关领域研究成为焦点[19-25]。 光照强度是影响铁皮石斛幼苗形态建成的重要因素。有研究发现，铁皮石斛试管苗在生长发育过程中的光饱和点和最大电子传递速率（ETRmax）变化相对比较稳定，范围内铁皮石斛试管苗生理活性较高，生长发育较快[32]。光强过大往往导致铁皮石斛叶色浓绿，苗体矮壮且幼苗增殖率大[33]。然而，不同光照强度条件下铁皮石斛植株上部农艺性状与下部根系性状的协调性及其与叶片生理活性的相关性的研究鲜见报道。本研究以铁皮石斛组培苗为试验材料，以组培室常用光强条件为对照，研究不同光强对铁皮石斛幼苗生长及生理特性的影响，旨在为铁皮石斛优质种苗规模化生产技术体系的建立提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
铁皮石斛（Dendrobium Officinale Kimura et Migo）由广东省农业科学院作物研究所南药研究室提供，种质编号为NY0091。实验材料为叶色均匀、叶片数2～3个、长势一致且高约1.5 cm、茎粗2 mm的铁皮石斛组培幼苗（单腋芽由茎端培养第4代后得到）。
1.2 方法
1.2.1 处理 培养容器选用容积标准组培玻璃瓶（直径7 cm，高10 cm）。培养基选用1/2MS+0.2 mg/L NAA+10%香蕉汁+0.1%活性炭，并添加25 g/L蔗糖和7 g/L琼脂，pH值调节在6.0左右，培养箱（PGX-1000A-12H）相对湿度为（70±5）%，温度为（25±1）℃，光照时间为12 h/d。每个玻璃瓶内分装35 mL培养基，分别移植6棵铁皮石斛组培幼苗。
试验设置4个光照强度处理：CK 25 μmol/（m2·s），T1 50 μmol/（m2·s），T2 75 μmol/（m2·s），T3 100 μmol/（m2·s）。自2011年12月10日起，每个光照培养箱内放置30瓶铁皮石斛幼苗，试验设置3次重复。
1.2.2 测定 铁皮石斛幼苗培养60 d后测量其农艺性状、根系性状和叶片生理活性。
（1）农艺性状。在每个光照培养箱内随机取20瓶种苗，测定并计算出其单苗茎粗（采用游标卡尺）、单苗鲜重、单苗绿叶数、每瓶苗数，3次重复的平均值即为各处理对应指标数值。
（2）根系性状。采用根分析系统（加拿大Regent RHIZO根系分析系统，与文献[34]所用仪器同）扫描样品平均根直径、单苗总根体积、单苗总根尖数、单苗总根长及单苗总根表面积。
（3）叶片生理活性。在每个光照培养箱内随机取10瓶幼苗，并分别使用502型SPAD仪测定完全展开顶1叶SPAD值，最后计算其平均值。蔗糖合成酶（SS，下同）活性参照文献[35]的方法。超氧化物歧化酶（SOD，下同）活性参照《植物生理学实验指导》[36]的方法测定。总含水量=（鲜质量-干质量）/鲜质量×100%。
1.2.3 数据处理 本研究采用Excel 2007整理实验数据，使用DPS软件按LSD法检测不同处理间差异显著性及进行相关分析。
2 结果与分析
2.1 光照强度对铁皮石斛植株上部幼苗生长的影响
相对于CK（对照），T1和T2处理均能显著提高铁皮石斛的单苗茎粗和单苗鲜重，对其单苗绿叶数和每瓶苗数无显著影响（表1）。然而，相对于对照，T3处理虽显著提高了铁皮石斛的单苗茎粗和单苗鲜重，却降低铁皮石斛的单苗绿叶数和每瓶苗数，其中每瓶苗数降幅高达25.92%。因此，相对于常规光强条件，较大的光照强度有利于提高铁皮石斛植株上部幼苗质量，结合植株侧芽发生数量考虑，光照强度适宜值范围为50～75 μmol/（m2·s），光照强度过大抑制植株侧芽数量。
2.2 光照强度对铁皮石斛幼苗根系性状的影响
相对于对照，T1、T2及T3处理均显著提高了铁皮石斛的单苗总根尖数（表2）。此外，T2处理还显著提高了铁皮石斛平均根直径、单苗总根体积。但是，T2和T3处理比较，其对铁皮石斛其它根系性状（如：平均根直径、单苗总根体积、单苗总根长及单苗总根表面积等）均无显著差异。因此，相对于常规组培光强条件，适当高光照强度有利于改善铁皮石斛植株根系生长状况，其中，效果最好的光照强度大小为75 μmol/（m2·s）。
2.3 光照强度对铁皮石斛幼苗生理特性的影响
增大光强有降低铁皮石斛叶片总含水量的趋势，但处理间均无显著差异（表3）。增大光强可提高铁皮石斛叶片叶绿素含量（用SPAD值大小表示），其中，T2和T3处理均极显著提高了铁皮石斛叶片的叶绿素含量。增大光强还有利于提高铁皮石斛叶片蔗糖合成酶活性，其中，T2和T3处理影响差异分别达显著水平和极显著水平。但是，T1、T2及T3处理则显著降低了铁皮石斛叶片的超氧化物歧化酶活性。
2.4 相关性分析
铁皮石斛试管苗总根尖数与叶片叶绿素含量呈极显著的正相关，且叶片叶绿素含量与叶片蔗糖合成酶活性呈极显著的正相关（表4）；茎粗与总根尖数呈显著正相关，与叶片叶绿素含量及蔗糖合成酶活性均呈极显著正相关。然茎粗与叶片总含水量、超氧化物歧化酶活性均呈极显著的负相关。
3 讨论与结论
光照条件是影响铁皮石斛优质试管种苗形成的重要因素。适宜的光照时间（12 h/d）有利于提高铁皮石斛组培苗的净光合速率和叶绿素含量、增加干重和腋芽数，从而促进生长发育[32]；适宜红蓝光的光质配比调节叶绿素a/b的比值，有利于促进试管苗的生长发育[26]。有学者认为组培室常用光强偏小可能是试管苗生长发育的主要限制因子之一，本研究支持上述观点。与传统组培光强内，茎粗和总根尖数是铁皮石斛试管苗形态建成的重要农艺指标，直观反映着种苗的外观质量，叶片叶绿素含量与其呈显著或极显著的正相关关系表明它可能是影响铁皮石斛试管苗幼苗素质的一项重要生理指标。增大光强有利于提高叶片叶绿素含量，这可能归因于较大光强下有较大的养分特别是氮素吸收能力[38]，而较大的氮素吸收能力又与良好的根系性状息息相关；适宜范围内光强越大，叶片叶绿素含量和蔗糖合成酶活性越高，光合同化力越强对于增粗增重有良效，这和丑敏霞等[37]研究结果类似，进一步解释了光强影响优质幼苗形成的生理机制。 参考文献
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责任编辑：沈德发
关键词 铁皮石斛；试管苗；根系性状；蔗糖合成酶；超氧化物歧化酶
中图分类号 S567 文献标识码 A
Effect of Light Intensity on Seedling Growth and
Physiological Characteristics of Dendrobium
officinale Kimura et Migo in vitro
LI Wu1，2， ZHENG Jingrong1，2， MO Zhaowen3， LI Zhijun1，2， JIANG Li2
QIU Daoshou1， CHAI Shike1， LIU Xiaojin1，2*
1 Crops Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640， China
2 Guangdong Golden Crops Agriculture Science & Technology Company， Guangzhou， Guangdong 510640， China
3 College of Agriculture， South China Agriculture University， Guangzhou， Guangdong 510642， China
Abstact The suitable light intensity has a great significance for cultivating high quality Dendrobium officinale seedlings in vitro. In the study， we used test-tube seedlings as the experimental material， and set four higher light intensity， T0（25 μmol/（m2·s）， T1（50 μmol/（m2·s）， T2（75 μmol/（m2·s）， T3（100 μmol/（m2·s）. T0 as the control was traditional light intersity level in tissue culture lab. We studied the effect of other treatments with higher light intensity on seedling growth and physiological characteristics. The results showed that， compared with T0， T2 increased significantly stem diameter per plant and fresh weight per plant under the premise of no significant influence on both green leaf number per plant and seedling number per bottle， respectively， also significantly increased the average diameter， root volume per plant and tips per plant， and coordinated the development of plant root traits and upper morphological characters， also significantly increased the SPAD value and SS activities of leaves. Correlation analysis also showed that， in a certain range of light intensity from 25 to 100 μmol/（m2·s）， the correlation of stem diameter per plant， tips per plant， leaf SS activity， and leaf SPAD value was significantly positive， respectively. So the appropriate light intensity level for the production of high quality tissue culture seedling of D. officinale was 75 μmol/（m2·s）. Besides， leaf SPAD value could be a key indicator of the seedling quality in D. officinale.
Key words Dendrobium officinale； Test-tube seedlings； Root traits； Sucrose synthase（SS）； Superoxide dismutase（SOD）
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.020
铁皮石斛（Dendrobium Officinale Kimura et Migo）是我国传统名贵中药，其主效成分包括特有的多糖[1-3]、生物碱[4]、菲类化合物[4]，以及除色氨酸以外的所有人体必需氨基酸和微量元素[5]等，具有增强免疫力[6-9]、抗肿瘤[10-11]、降血糖[12-13]、抗氧化[11，14-17]等药理作用，在治疗胃肠道疾病、白内障、关节炎、血栓闭塞性脉管炎及慢性咽炎等疾病有很好的临床疗效[18]。近年来，野生资源因人为的过度采挖及其生境的严重破坏已濒临灭绝，而铁皮石斛因种子极小、无胚乳，在自然条件下需与真菌共生才能萌发，其实生苗很难满足日益增长的人工栽培用种需要。目前，利用组织培养技术快速繁殖试管苗是解决铁皮石斛种苗需求的有效途径，相关领域研究成为焦点[19-25]。 光照强度是影响铁皮石斛幼苗形态建成的重要因素。有研究发现，铁皮石斛试管苗在生长发育过程中的光饱和点和最大电子传递速率（ETRmax）变化相对比较稳定，范围内铁皮石斛试管苗生理活性较高，生长发育较快[32]。光强过大往往导致铁皮石斛叶色浓绿，苗体矮壮且幼苗增殖率大[33]。然而，不同光照强度条件下铁皮石斛植株上部农艺性状与下部根系性状的协调性及其与叶片生理活性的相关性的研究鲜见报道。本研究以铁皮石斛组培苗为试验材料，以组培室常用光强条件为对照，研究不同光强对铁皮石斛幼苗生长及生理特性的影响，旨在为铁皮石斛优质种苗规模化生产技术体系的建立提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
铁皮石斛（Dendrobium Officinale Kimura et Migo）由广东省农业科学院作物研究所南药研究室提供，种质编号为NY0091。实验材料为叶色均匀、叶片数2～3个、长势一致且高约1.5 cm、茎粗2 mm的铁皮石斛组培幼苗（单腋芽由茎端培养第4代后得到）。
1.2 方法
1.2.1 处理 培养容器选用容积标准组培玻璃瓶（直径7 cm，高10 cm）。培养基选用1/2MS+0.2 mg/L NAA+10%香蕉汁+0.1%活性炭，并添加25 g/L蔗糖和7 g/L琼脂，pH值调节在6.0左右，培养箱（PGX-1000A-12H）相对湿度为（70±5）%，温度为（25±1）℃，光照时间为12 h/d。每个玻璃瓶内分装35 mL培养基，分别移植6棵铁皮石斛组培幼苗。
试验设置4个光照强度处理：CK 25 μmol/（m2·s），T1 50 μmol/（m2·s），T2 75 μmol/（m2·s），T3 100 μmol/（m2·s）。自2011年12月10日起，每个光照培养箱内放置30瓶铁皮石斛幼苗，试验设置3次重复。
1.2.2 测定 铁皮石斛幼苗培养60 d后测量其农艺性状、根系性状和叶片生理活性。
（1）农艺性状。在每个光照培养箱内随机取20瓶种苗，测定并计算出其单苗茎粗（采用游标卡尺）、单苗鲜重、单苗绿叶数、每瓶苗数，3次重复的平均值即为各处理对应指标数值。
（2）根系性状。采用根分析系统（加拿大Regent RHIZO根系分析系统，与文献[34]所用仪器同）扫描样品平均根直径、单苗总根体积、单苗总根尖数、单苗总根长及单苗总根表面积。
（3）叶片生理活性。在每个光照培养箱内随机取10瓶幼苗，并分别使用502型SPAD仪测定完全展开顶1叶SPAD值，最后计算其平均值。蔗糖合成酶（SS，下同）活性参照文献[35]的方法。超氧化物歧化酶（SOD，下同）活性参照《植物生理学实验指导》[36]的方法测定。总含水量=（鲜质量-干质量）/鲜质量×100%。
1.2.3 数据处理 本研究采用Excel 2007整理实验数据，使用DPS软件按LSD法检测不同处理间差异显著性及进行相关分析。
2 结果与分析
2.1 光照强度对铁皮石斛植株上部幼苗生长的影响
相对于CK（对照），T1和T2处理均能显著提高铁皮石斛的单苗茎粗和单苗鲜重，对其单苗绿叶数和每瓶苗数无显著影响（表1）。然而，相对于对照，T3处理虽显著提高了铁皮石斛的单苗茎粗和单苗鲜重，却降低铁皮石斛的单苗绿叶数和每瓶苗数，其中每瓶苗数降幅高达25.92%。因此，相对于常规光强条件，较大的光照强度有利于提高铁皮石斛植株上部幼苗质量，结合植株侧芽发生数量考虑，光照强度适宜值范围为50～75 μmol/（m2·s），光照强度过大抑制植株侧芽数量。
2.2 光照强度对铁皮石斛幼苗根系性状的影响
相对于对照，T1、T2及T3处理均显著提高了铁皮石斛的单苗总根尖数（表2）。此外，T2处理还显著提高了铁皮石斛平均根直径、单苗总根体积。但是，T2和T3处理比较，其对铁皮石斛其它根系性状（如：平均根直径、单苗总根体积、单苗总根长及单苗总根表面积等）均无显著差异。因此，相对于常规组培光强条件，适当高光照强度有利于改善铁皮石斛植株根系生长状况，其中，效果最好的光照强度大小为75 μmol/（m2·s）。
2.3 光照强度对铁皮石斛幼苗生理特性的影响
增大光强有降低铁皮石斛叶片总含水量的趋势，但处理间均无显著差异（表3）。增大光强可提高铁皮石斛叶片叶绿素含量（用SPAD值大小表示），其中，T2和T3处理均极显著提高了铁皮石斛叶片的叶绿素含量。增大光强还有利于提高铁皮石斛叶片蔗糖合成酶活性，其中，T2和T3处理影响差异分别达显著水平和极显著水平。但是，T1、T2及T3处理则显著降低了铁皮石斛叶片的超氧化物歧化酶活性。
2.4 相关性分析
铁皮石斛试管苗总根尖数与叶片叶绿素含量呈极显著的正相关，且叶片叶绿素含量与叶片蔗糖合成酶活性呈极显著的正相关（表4）；茎粗与总根尖数呈显著正相关，与叶片叶绿素含量及蔗糖合成酶活性均呈极显著正相关。然茎粗与叶片总含水量、超氧化物歧化酶活性均呈极显著的负相关。
3 讨论与结论
光照条件是影响铁皮石斛优质试管种苗形成的重要因素。适宜的光照时间（12 h/d）有利于提高铁皮石斛组培苗的净光合速率和叶绿素含量、增加干重和腋芽数，从而促进生长发育[32]；适宜红蓝光的光质配比调节叶绿素a/b的比值，有利于促进试管苗的生长发育[26]。有学者认为组培室常用光强偏小可能是试管苗生长发育的主要限制因子之一，本研究支持上述观点。与传统组培光强内，茎粗和总根尖数是铁皮石斛试管苗形态建成的重要农艺指标，直观反映着种苗的外观质量，叶片叶绿素含量与其呈显著或极显著的正相关关系表明它可能是影响铁皮石斛试管苗幼苗素质的一项重要生理指标。增大光强有利于提高叶片叶绿素含量，这可能归因于较大光强下有较大的养分特别是氮素吸收能力[38]，而较大的氮素吸收能力又与良好的根系性状息息相关；适宜范围内光强越大，叶片叶绿素含量和蔗糖合成酶活性越高，光合同化力越强对于增粗增重有良效，这和丑敏霞等[37]研究结果类似，进一步解释了光强影响优质幼苗形成的生理机制。 参考文献
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