【摘 要】
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目的:构建骨关节炎滑膜组织的cDNA文库,为筛选与骨关节炎的发生特异相关的基因及探讨骨关节炎发病机制奠定基础.方法:实验于2006-01/10在深圳市人民医院骨关节科完成,选取骨
【机 构】
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华中科技大学附属协和医院骨科,深圳市第二人民医院骨关节科,深圳市人民医院骨关节科,吉林市北华大学医学院检验系
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目的:构建骨关节炎滑膜组织的cDNA文库,为筛选与骨关节炎的发生特异相关的基因及探讨骨关节炎发病机制奠定基础.方法:实验于2006-01/10在深圳市人民医院骨关节科完成,选取骨关节炎患者滑膜,以Trizol一步法从骨关节炎滑膜组织中提取总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,以pBlueScriptll为载体,构建关节炎滑膜组织cDNA文库,对随机挑取的克隆进行鉴定.结果:①总RNA及mRNA的质量:总RNA经分光光度计测定,测得mRNA的A260nm吸光度值为0.245,平均得率为0.45 g/L,A260nm/A280nm=1.84,无DNA、蛋白质及小分子污染.符合建库要求.②cDNA的合成及分析:10μgmRNA反转录合成cDNA,合成的cDNA大小为0.5～9.0 kb,且主要集中在1.0～2.0 kb之间.③文库的鉴定:将50 ng的cDNA与质粒载体pBlueScriptll 连接过夜,采用电转化法转化受体菌DH5A,经稀释铺板测定原始文库的滴度为1.45×109pfu/L,总克隆数为4.6×105,重组率为96.2%,扩增后文库总滴度为6.4×1012pfu/L,插入片段多分布在0.5～2.6 kb之间.结论:构建关节炎滑膜组织cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段,为克隆关节炎相关功能基因的研究奠定了基础.
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