论文部分内容阅读
前期通过分泌蛋白质谱分析和转录组测序，确定了一株高产漆酶的白腐菌为灵芝，其分泌漆酶的编码基因为lcc1。本研究PCR扩增lcc1基因的基因组序列（lcc1-D）和cDNA序列（lcc1-C），分别构建表达载体（pSZH6R-lcc1-D、pSZH6R-lcc1-C）。通过农杆菌介导法转化黑曲霉TH-2，筛选出在糖化酶基因glaA位点发生同源重组的纯合黑曲霉转化子。摇瓶发酵后取发酵液上清进行Native-PAGE检测和酶活测定，结果表明，重组菌株lcc1-C的漆酶表达量和酶活力高于lcc1-D，酶活力最高值分别为431.94 U/L和218.06 U/L。Real-time PCR结果表明，lcc1-C中的漆酶mRNA水平是lcc1-D的3.38倍。对重组漆酶进行酶学性质分析，发现其最适反应温度为 60 ℃、最适pH 为 3.5。在染料脱色实验中发现重组漆酶对孔雀石绿、中性红、甲基橙具有明显脱色作用，对蒽醌类染料RBBR无脱色作用，介体存在时能增强漆酶对染料的脱色效果，对中性红脱色效率最强，48 h脱色率可达到91.21%。为改善重组漆酶的折叠，向重组菌株lcc1-C的发酵培养基中添加渗透调节剂，结果显示，在添加0.4 mol/L TMAO时酶活力达到1301.67 U/L，提高了2.01倍；在添加0.5 mol/L脯氨酸时酶活力达到2037.22 U/L，提高了3.72倍；在添加0.5 mol/L甘氨酸时酶活力达到1434.03 U/L，酶活力提高了2.32倍。