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摘要[目的] 研究盐碱地产脂肪酶的中度嗜盐菌菌株的形态和生理生化特点及其所产胞外脂肪酶的性质。 [方法]利用平板筛选法分离得到一株产脂肪酶中度嗜盐菌，对其进行形态、生理生化和分子水平的鑒定，并对其产生的脂肪酶的部分酶学性质进行研究。[结果]产脂肪酶的菌株命名为Nesterenkonia halobia sp.ZF03。对脂肪酶粗酶液酶学性质的研究结果显示该脂肪酶的最适反应温度在46～50 ℃之间，温度小于70 ℃时的稳定性较好；最适pH为8.5，在pH 7.5～9.5范围内，相对酶活性较高，酶具有良好的稳定性；反应的最适NaCl浓度为0～3%，在0～5% NaCl浓度下有很好的稳定性。[结论]分离得到了一株产脂肪酶活性较高的中度嗜盐菌。
关键词中度嗜盐菌；脂肪酶；鉴定；酶学性质
中图分类号S181.3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01138-03
基金项目2013年度大学生创新创业训练计划项目（201310225116）；中央高校基本科研业务费专项资金资助（DL11CA01）；东北林业大学国家基础科学人才培养基金——科研训练及科研能力提高项目（201218A3）；哈尔滨市青年科技创新人才基金资助项目（RC2009QN015018）；黑龙江省自然科学基金面上资助项目（E201148）。
作者简介赵喜云（1989- ），女，山东聊城人，本科生，专业：环境微生物。*通讯作者，副教授，博士，从事环境微生物研究。
中度嗜盐菌是一群能在含有0～32%NaCl的环境中生长的极端环境微生物。在所有嗜盐微生物中，中度嗜盐菌在自然界中广泛分布可生长的盐度范围最广，由于中度嗜盐菌独特的生理性质，其功能酶具有较大范围的盐耐受性、热耐受性和对有机溶剂的抗性，在酶工业中，其所生产的酶制剂在特殊条件的生产和研究中可以保持较好的活性，因此，中度嗜盐菌在工业生产中有着重要的研究价值和广阔的应用前景[1-2]。
由于工业生产中某些生产条件的限制，已有的水解酶往往达不到最大活性，因此寻找能够适应不同温度、酸碱度以及盐水活度的极端水解酶就成为一类重要的课题[3-5]。该研究分离得到了一株产脂肪酶活性较高的中度嗜盐菌，经形态学、生理生化及16S rDNA序列分析鉴定，初步命名为Nesterenkonia halobia sp.ZF03，并对其不同温度、pH、盐度条件下的酶学性质进行了研究，为进一步提高酶活性并进行工业化生产提供了新思路。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1土样。试验土样为大庆采油四厂附近的盐碱土。
1.1.2培养基。富集培养基：酵母粉6 g/L，酸水解酪蛋白5 g/L，蛋白胨6 g/L，柠檬酸钠3 g/L，KCl 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，FeSO4 0.001 g/L，NaCl 30～120 g/L（不同盐度梯度），蒸馏水至1 000 ml，pH为7.5～8.0。
脂肪酶发酵培养基：酸水解酪蛋白5 g/L，酵母粉6 g/L，蛋白胨6 g/L，柠檬酸钠3 g/L，KCl 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，FeSO4 0.001 g/L，NaCl（视需要量），20 ml橄榄油乳化液，蒸馏水至1 000 ml。
基础发酵培养基或种子培养基：同富集筛选培养基。
以上培养基固体平板均加入18～20 g/L琼脂。
1.1.3主要试剂。Taq酶、dNTP、Taq酶buffer、16S rDNA通用引物购自大连TaKaRa公司，凝胶回收试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1菌种的筛选。参考文献[6]进行产脂肪酶菌种的筛选。
1.2.2菌种鉴定。
1.2.2.1形态学鉴定。将分离得到的纯菌点种于固体种子培养基中，37 ℃培养18 h，记录单菌落的颜色，包括正反面、边缘、中央部分颜色，记录单菌落的形状，包括菌落及边缘的形状，记录菌落透明度、大小、表面隆起及菌落培养基的颜色等。在光学显微镜下观察细胞形态大小。并做革兰氏染色、芽孢染色及细胞运动性试验。
1.2.2.2生理生化鉴定。参照文献[7]进行氧化酶、过氧化氢酶、酯酶、脂肪酶、淀粉酶、酪素降解、明胶水解等生理生化鉴定。
1.2.2.316S rDNA分子鉴定。参考文献[8-9]进行16S rDNA分子鉴定，利用ClustalX 1.83软件进行同源性分析，再用MEGA 4.0软件中N-J法构建系统发育树。
1.2.3酯酶活力测定。参照文献[9]方法制备粗酶液，测定脂肪酶活力。
2结果与分析
2.1菌株的筛选获得了几株产脂肪酶菌株，其中一株水解圈直径17.33 mm，菌落直径4.33 mm，酶活力较高，为7.18 U/ml，命名为ZF03。
2.2菌株的鉴定
2.2.1形态及生理生化特征。将ZF03菌株于37 ℃条件下倒置培养3 d 后，观察到的菌落形态为圆形，表面光滑，不透明，边缘整齐，菌落白色，中间稍凸起，不粘稠，光滑无皱纹。菌体染色后，在光学显微镜下观察菌体，细胞呈球状、多联球或成团，革兰氏染色呈阳性，无芽孢、穿刺培养无扩散现象。生理生化特性试验结果中酯酶、硝酸盐还原、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、脂肪酶、蔗糖反应为阳性结果；氧化酶、过氧化氢酶、淀粉酶、酪素降解、明胶水解、吲哚反应、H2S产生、乳糖、果糖反应为阴性结果。
2.2.216S rDNA分子鉴定。将ZF03菌株的16S rDNA 序列进行PCR、电泳回收纯化后直接进行测序分析，最终确定所得序列长度为1 416 bp。 在NCBI中，将所得序列结果进行Blast同源性查找比对，并用MEGA 4.0软件中NJ法构建ZF03菌株的系统发育树，结果如图1所示。图2表明与ZF03菌株的序列同源性达到97%以上的都是Nesterenkonia属的菌种，ZF03与Nesterenkonia halobia strain DSM 20541和Nesterenkonia halophila strain YIM 70179的亲缘关系最近，而ZF03与YIM 70179的形态学特征理化性质基本一致，因此，菌种ZF03可能就是YIM 70179或者是同一祖先进化的产物。可以确定的是ZF03为耐盐的涅斯捷连科氏菌（Nesterenkonia halobia）[9-10]，所以暂且命名为Nesterenkonia halobia sp.ZF03。
2.3.1温度对ZF03脂肪酶活性的影响。
2.3.1.1ZF-03脂肪酶最适反应温度。在不同温度条件下保温15 min利用对硝基苯酚棕榈酸酯为反应底物，加入粗酶液1 ml，反应10 min在410 nm波长下测定脂肪酶活性。以相对酶活性为纵坐标来表示测定结果（即活性最高的为100%），以下测定同此。由图2可见，在45～55 ℃条件下脂肪酶活性比较高，最适反应温度在46～50 ℃之间，当反应温度超过55 ℃后，随着温度的升高，脂肪酶活性在下降。
2.3.2.1ZF03脂肪酶最适反应pH。将酶分别加入不同pH的反应液中，最适宜反应温度下测定酶活力，结果见图4。由图4可见，脂肪酶与底物作用的最适pH为8.5，此时酶活力最大，在pH为7.5～9.5范围内，酶反应的活力较高，小于7.5或者大于9.5时，该酶活性呈明显降低的趋势。
2.3.3.1ZF03脂肪酶最适反应NaCl浓度。配制不同盐度0、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%（W/V）的反应液，在最适pH和最适温度下，加入底物反应10 min，然后测定酶活力。由图6可见，反应的最适NaCl浓度为0～3%，但在0～10%浓度下相对酶活性也可以达到80%以上，当盐浓度大约15%时，酶活力快速减弱，可能高盐环境抑制了酶的活性。
3结论
（1）从大庆采油厂附近盐碱土中分离筛选出一株高产脂肪酶的中度嗜盐菌，经形态学、生理生化及16S rDNA序列分图7NaCl浓度对脂肪酶稳定性的影响析把其命名为Nesterenkonia halobia sp.ZF03。
（2）对脂肪酶粗酶液酶学性质的研究结果显示该脂肪酶的最适反应温度在46～50 ℃之间，温度小于70 ℃时的稳定性较好；最适pH为9.0，在pH 7.0～9.5范围内，相对酶活性较高，酶具有良好稳定性；反应的最适NaCl浓度为0～3%，在0～5% NaCl浓度下有很好的稳定性。
（3）该研究摸索出了一种筛选盐碱土中产脂肪酶中度嗜盐菌的方法，分离鉴定出了产脂肪酶中度嗜盐菌的新菌株，并对其不同温度、pH、盐度条件下的酶学性质进行了研究，为进一步提高酶活性并进行工业化生产提供了新思路。
参考文献
[1] 冯二梅，宿红艳，王磊.中度嗜盐菌的研究进展[J].安徽农业科学，2009，37（31）：15125-15126，15190.
[2] 李维国，马放，魏利，等.一株中度嗜盐菌的分离鉴定研究[J].深圳大学学报：理工版，2008，25（2）：200-201.
[3] JAVOR B J.Industrial microbiology of solar salt production[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2002，28：42-47.
[4] BIRBIR M，SESAL C.Extremely halophilic bacterial communities in fiereflikochisar salt lake in Turkey[J].Turkish Journal of Biology，2003，27：7-22.
[5] OREB A.Molecular ecology of extremely halophilic archaea and bacterial[J].FEMS Microbiology Ecology，2002，39：1-7.
[6] 張晓梅，窦文芳，许泓瑜，等.一株产脂肪酶嗜盐菌的鉴定及耐盐机理[J].应用与环境生物学报，2010，16（1）：100-103.
关键词中度嗜盐菌；脂肪酶；鉴定；酶学性质
中图分类号S181.3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01138-03
基金项目2013年度大学生创新创业训练计划项目（201310225116）；中央高校基本科研业务费专项资金资助（DL11CA01）；东北林业大学国家基础科学人才培养基金——科研训练及科研能力提高项目（201218A3）；哈尔滨市青年科技创新人才基金资助项目（RC2009QN015018）；黑龙江省自然科学基金面上资助项目（E201148）。
作者简介赵喜云（1989- ），女，山东聊城人，本科生，专业：环境微生物。*通讯作者，副教授，博士，从事环境微生物研究。
中度嗜盐菌是一群能在含有0～32%NaCl的环境中生长的极端环境微生物。在所有嗜盐微生物中，中度嗜盐菌在自然界中广泛分布可生长的盐度范围最广，由于中度嗜盐菌独特的生理性质，其功能酶具有较大范围的盐耐受性、热耐受性和对有机溶剂的抗性，在酶工业中，其所生产的酶制剂在特殊条件的生产和研究中可以保持较好的活性，因此，中度嗜盐菌在工业生产中有着重要的研究价值和广阔的应用前景[1-2]。
由于工业生产中某些生产条件的限制，已有的水解酶往往达不到最大活性，因此寻找能够适应不同温度、酸碱度以及盐水活度的极端水解酶就成为一类重要的课题[3-5]。该研究分离得到了一株产脂肪酶活性较高的中度嗜盐菌，经形态学、生理生化及16S rDNA序列分析鉴定，初步命名为Nesterenkonia halobia sp.ZF03，并对其不同温度、pH、盐度条件下的酶学性质进行了研究，为进一步提高酶活性并进行工业化生产提供了新思路。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1土样。试验土样为大庆采油四厂附近的盐碱土。
1.1.2培养基。富集培养基：酵母粉6 g/L，酸水解酪蛋白5 g/L，蛋白胨6 g/L，柠檬酸钠3 g/L，KCl 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，FeSO4 0.001 g/L，NaCl 30～120 g/L（不同盐度梯度），蒸馏水至1 000 ml，pH为7.5～8.0。
脂肪酶发酵培养基：酸水解酪蛋白5 g/L，酵母粉6 g/L，蛋白胨6 g/L，柠檬酸钠3 g/L，KCl 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，FeSO4 0.001 g/L，NaCl（视需要量），20 ml橄榄油乳化液，蒸馏水至1 000 ml。
基础发酵培养基或种子培养基：同富集筛选培养基。
以上培养基固体平板均加入18～20 g/L琼脂。
1.1.3主要试剂。Taq酶、dNTP、Taq酶buffer、16S rDNA通用引物购自大连TaKaRa公司，凝胶回收试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1菌种的筛选。参考文献[6]进行产脂肪酶菌种的筛选。
1.2.2菌种鉴定。
1.2.2.1形态学鉴定。将分离得到的纯菌点种于固体种子培养基中，37 ℃培养18 h，记录单菌落的颜色，包括正反面、边缘、中央部分颜色，记录单菌落的形状，包括菌落及边缘的形状，记录菌落透明度、大小、表面隆起及菌落培养基的颜色等。在光学显微镜下观察细胞形态大小。并做革兰氏染色、芽孢染色及细胞运动性试验。
1.2.2.2生理生化鉴定。参照文献[7]进行氧化酶、过氧化氢酶、酯酶、脂肪酶、淀粉酶、酪素降解、明胶水解等生理生化鉴定。
1.2.2.316S rDNA分子鉴定。参考文献[8-9]进行16S rDNA分子鉴定，利用ClustalX 1.83软件进行同源性分析，再用MEGA 4.0软件中N-J法构建系统发育树。
1.2.3酯酶活力测定。参照文献[9]方法制备粗酶液，测定脂肪酶活力。
2结果与分析
2.1菌株的筛选获得了几株产脂肪酶菌株，其中一株水解圈直径17.33 mm，菌落直径4.33 mm，酶活力较高，为7.18 U/ml，命名为ZF03。
2.2菌株的鉴定
2.2.1形态及生理生化特征。将ZF03菌株于37 ℃条件下倒置培养3 d 后，观察到的菌落形态为圆形，表面光滑，不透明，边缘整齐，菌落白色，中间稍凸起，不粘稠，光滑无皱纹。菌体染色后，在光学显微镜下观察菌体，细胞呈球状、多联球或成团，革兰氏染色呈阳性，无芽孢、穿刺培养无扩散现象。生理生化特性试验结果中酯酶、硝酸盐还原、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、脂肪酶、蔗糖反应为阳性结果；氧化酶、过氧化氢酶、淀粉酶、酪素降解、明胶水解、吲哚反应、H2S产生、乳糖、果糖反应为阴性结果。
2.2.216S rDNA分子鉴定。将ZF03菌株的16S rDNA 序列进行PCR、电泳回收纯化后直接进行测序分析，最终确定所得序列长度为1 416 bp。 在NCBI中，将所得序列结果进行Blast同源性查找比对，并用MEGA 4.0软件中NJ法构建ZF03菌株的系统发育树，结果如图1所示。图2表明与ZF03菌株的序列同源性达到97%以上的都是Nesterenkonia属的菌种，ZF03与Nesterenkonia halobia strain DSM 20541和Nesterenkonia halophila strain YIM 70179的亲缘关系最近，而ZF03与YIM 70179的形态学特征理化性质基本一致，因此，菌种ZF03可能就是YIM 70179或者是同一祖先进化的产物。可以确定的是ZF03为耐盐的涅斯捷连科氏菌（Nesterenkonia halobia）[9-10]，所以暂且命名为Nesterenkonia halobia sp.ZF03。
2.3.1温度对ZF03脂肪酶活性的影响。
2.3.1.1ZF-03脂肪酶最适反应温度。在不同温度条件下保温15 min利用对硝基苯酚棕榈酸酯为反应底物，加入粗酶液1 ml，反应10 min在410 nm波长下测定脂肪酶活性。以相对酶活性为纵坐标来表示测定结果（即活性最高的为100%），以下测定同此。由图2可见，在45～55 ℃条件下脂肪酶活性比较高，最适反应温度在46～50 ℃之间，当反应温度超过55 ℃后，随着温度的升高，脂肪酶活性在下降。
2.3.2.1ZF03脂肪酶最适反应pH。将酶分别加入不同pH的反应液中，最适宜反应温度下测定酶活力，结果见图4。由图4可见，脂肪酶与底物作用的最适pH为8.5，此时酶活力最大，在pH为7.5～9.5范围内，酶反应的活力较高，小于7.5或者大于9.5时，该酶活性呈明显降低的趋势。
2.3.3.1ZF03脂肪酶最适反应NaCl浓度。配制不同盐度0、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%（W/V）的反应液，在最适pH和最适温度下，加入底物反应10 min，然后测定酶活力。由图6可见，反应的最适NaCl浓度为0～3%，但在0～10%浓度下相对酶活性也可以达到80%以上，当盐浓度大约15%时，酶活力快速减弱，可能高盐环境抑制了酶的活性。
3结论
（1）从大庆采油厂附近盐碱土中分离筛选出一株高产脂肪酶的中度嗜盐菌，经形态学、生理生化及16S rDNA序列分图7NaCl浓度对脂肪酶稳定性的影响析把其命名为Nesterenkonia halobia sp.ZF03。
（2）对脂肪酶粗酶液酶学性质的研究结果显示该脂肪酶的最适反应温度在46～50 ℃之间，温度小于70 ℃时的稳定性较好；最适pH为9.0，在pH 7.0～9.5范围内，相对酶活性较高，酶具有良好稳定性；反应的最适NaCl浓度为0～3%，在0～5% NaCl浓度下有很好的稳定性。
（3）该研究摸索出了一种筛选盐碱土中产脂肪酶中度嗜盐菌的方法，分离鉴定出了产脂肪酶中度嗜盐菌的新菌株，并对其不同温度、pH、盐度条件下的酶学性质进行了研究，为进一步提高酶活性并进行工业化生产提供了新思路。
参考文献
[1] 冯二梅，宿红艳，王磊.中度嗜盐菌的研究进展[J].安徽农业科学，2009，37（31）：15125-15126，15190.
[2] 李维国，马放，魏利，等.一株中度嗜盐菌的分离鉴定研究[J].深圳大学学报：理工版，2008，25（2）：200-201.
[3] JAVOR B J.Industrial microbiology of solar salt production[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2002，28：42-47.
[4] BIRBIR M，SESAL C.Extremely halophilic bacterial communities in fiereflikochisar salt lake in Turkey[J].Turkish Journal of Biology，2003，27：7-22.
[5] OREB A.Molecular ecology of extremely halophilic archaea and bacterial[J].FEMS Microbiology Ecology，2002，39：1-7.
[6] 張晓梅，窦文芳，许泓瑜，等.一株产脂肪酶嗜盐菌的鉴定及耐盐机理[J].应用与环境生物学报，2010，16（1）：100-103.