氧化应激被认为是年龄相关性白内障发生的主要因素之一,研究表明蛋氨酸亚砜还原酶B1(MsrB1)对于保护晶状体细胞抵抗氧化应激具有重要作用,然而,MsrB1基因沉默对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞(LECs)的凋亡影响的机制尚不十分清楚。
目的探讨MsrB1基因沉默对H2O2诱导的人LECs凋亡及其细胞周期分布的影响。
方法人LECs细胞系SRA01/04在DMEM中进行培养,不同浓度的H2O2(200、400、600、800和1 000 μmol/L)加入培养基分别处理细胞12、24和36 h以选择最适浓度和作用时间。细胞分为正常对照组、MsrB1 siRNA转染组(将MsrB1 siRNA Lipofectamine 2000质粒转染入LECs)、H2O2诱导组(200 μmol/L作用LECs 24 h)和MsrB1 siRNA转染联合H2O2诱导组(转染MsrB1 siRNA脂质质粒后用H2O2处理细胞)。采用MTT法检测不同浓度H2O2诱导后人LECs 12、24和36 h细胞的存活率,并筛选H2O2处理作用最适的浓度和时间,用于进一步的细胞凋亡诱导实验;Real-time PCR法检测MsrB1 siRNA转染后24 h各组细胞中MsrB1 mRNA的相对表达水平;采用Hoechst 33528染色法观察各组细胞的细胞核形态变化;采用碘化丙啶(PI)染色法,用流式细胞仪检测细胞凋亡率和不同细胞周期的细胞比例。
结果正常对照组、H2O2诱导组、MsrB1 siRNA转染组细胞中MsrB1 mRNA的相对表达值为1.063±0.058、1.013±0.049和0.235±0.024,MsrB1 siRNA转染组细胞中MsrB1 mRNA的相对表达值明显低于正常对照组和H2O2诱导组,差异均有统计学意义(t=31.744、35.807,均P<0.001)。不同浓度H2O2处理后24 h细胞活力最低,以200 μmol/L H2O2处理后24 h为诱导人LECs凋亡的浓度和时间点。Hoechst 33528染色显示,H2O2诱导组可见部分细胞核收缩,MsrB1 siRNA转染组可见少数收缩变小的细胞核,MsrB1 siRNA转染联合H2O2诱导组收缩变小的细胞核多于H2O2诱导组。流式细胞术检测结果显示,正常对照组的凋亡细胞占(1.36±0.35)%,而MsrB1 siRNA转染组占(3.26±0.31)%,H2O2诱导组和MsrB1 siRNA转染联合H2O2诱导组细胞的凋亡率明显上升,分别为(5.13±0.59)%和(8.73±0.48)%。细胞周期检测结果表明,H2O2诱导组细胞周期阻滞在G2/M期。MsrB1 siRNA转染联合H2O2诱导组人LECs G1期所占比例为(52.78±1.68)%,明显高于H2O2诱导组的(44.99±1.37)%,而G2/M期细胞比例为(34.97±2.31)%,明显低于H2O2诱导组的(42.39±1.41)%,差异均有统计学意义(t=6.224、-6.213,均P<0.01)。
结论MsrB1基因通过调节细胞周期的细胞分布减少H2O2诱导的人LECs的凋亡。