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摘要：目的 采用高效液相色谱法建立同时测定葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量的方法。方法 样品采用离子液体分散液相微萃取法提取。色谱条件：Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.2%冰醋酸溶液（45∶55），检测波长250 nm，柱温35 ℃，流速0.8 mL/min。结果 葛根素、大豆苷和大豆苷元的质量与峰面积分别在6.24×10-6～37.44 μg （r=0.999 71）、5.44×10-6～27.20 μg （r=0.999 85）、5.60×10-6～28.00 μg（r=0.999 94）范围内呈良好的线性关系。结论 该方法快速、简便、重复性好，适于同时测定葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量。
关键词：葛根；葛根素；大豆苷；大豆苷元；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）10-0067-04
Abstract：Objective To develop a sensitive and specific HPLC method to simultaneously determine the contents of puerarin， daidzin and daidzein in Puerariae Lobatae Radix. Methods The three compounds were obtained by ionic liquid based on dispersive liquid phase microextraction. The determination was carried out on a Phenomenex C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） with a mixture of methanol-0.2% acetic acid （volume ration 45∶55） as mobile phase at a flow rate of 0.8 mL/min. The UV detective wavelength was 250 nm， and the column temperature was set at 35 ℃. Results The linear response ranged from 6.24×10-6-37.44 μg for puerarin （r=0.999 71）， 5.44×10-6-27.20 μg for daidzin （r=0.999 85）， and 5.60×10-6-28.00 μg for daidzein （r=0.999 94）， respectively. Conclusion The method is quick， simple and repeatable for simultaneous determination of the contents of puerarin， daidzin and daidzein in Puerariae Lobatae Radix.
Key words：Puerariae Lobatae Radix；puerarin；daidzin；daidzein；HPLC
葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata （Willd.） Ohwi的干燥根，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻作用，用于治疗外感发热头痛、项背强痛、口渴、麻疹不透、泄泻等[1]。现代研究表明，葛根中的主要有效成分为葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类化合物，具有降低血管阻力、改善心脑血液循环、减慢心率、降低心肌耗氧量、抑制动脉硬化、抗肿瘤、神经组织保护等作用[2-3]。因此，对葛根中异黄酮类物质的测定具有重要的临床意义。目前，葛根中葛根素、大豆苷、大豆苷元的测定报道较多[4-6]，但这些测定在前处理方法上基本采用传统的有机溶剂乙醇作提取剂，溶剂易挥发，且大量使用会对人体造成伤害。本试验采用离子液体分散液相微萃取法（ionic liquid based dispersive liquid phase microextraction，ILDLPME）对目标物进行提取，以期减少有机溶剂的使用。
ILDLPME是基于离子液体、分散剂和水的三元混合溶剂体系的样品前处理方法。离子液体具有不易挥发、性质稳定、蒸气压低及对有机物有良好的溶解性等优点，作为“绿色溶剂”在萃取分离领域得到了广泛的应用[7-8]。本试验研究异黄酮类化合物分散液相微萃取行为并对葛根中异黄酮类物质进行提取、分离，结合高效液相色谱法（HPLC），快速测定其中的葛根素、大豆苷、大豆苷元含量。
1 仪器与试药
LC-20AT液相色谱输液泵、SPD-20A紫外检测器、CTO-10AS柱温箱、LC-Solution色谱数据处理系统，日本岛津公司；KH-3200B型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；TGL-16G高速离心机，上海安亭科学仪器厂；SZ-2自动双重纯化水蒸馏器，上海泸西分析仪器；FA2004A型分析天平，上海云祥电子有限公司。
葛根素、大豆苷、大豆苷元对照品（纯度均≥98.5%，上海晶纯实业有限公司）；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（1-Butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate，[Bmim][PF6]，纯度97%）， 1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（1-Hexyl-3- methylimidazolium hexafluorophosphate，[Hmim]
[PF6]，纯度97%），1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（1-octyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate， [Omim][PF6]，纯度97%），上海成捷化学有限公司；甲醇、乙醇、冰醋酸均为分析纯，重庆川东化工有限公司化学试剂厂；磷酸，分析纯，成都市科龙化工试剂厂；二次蒸馏水，实验室自制。葛根饮片购自当地药房，经西南大学周光明教授鉴定为豆科植物野葛Pueraria lobata （Willd.） Ohwi的干燥根。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
分别精密称取葛根素、大豆苷、大豆苷元对照品，甲醇超声溶解，配制成葛根素2340 μg/mL、大豆苷2040 μg/mL、大豆苷元2100 μg/mL的对照品母液。再分别准确吸取3种对照品母液适量，用流动相配制成一系列不同浓度的混合对照品溶液，0.45 μm有机滤膜过滤，4 ℃冰箱保存备用。
2.2 供试品溶液的制备和分散液相微萃取操作方法
称取0.10 g葛根样品，用纯水对样品其进行超声处理（150 W，40 kHz）30 min，制备成供试品溶液，经0.45 μm有机滤膜过滤，4 ℃冰箱保存备用。
移取5 mL供试品溶液至5 mL带塞的尖底离心试管中，快速注入300 μL[Hmim][PF6]萃取剂和0.5 mL甲醇分散剂，涡漩混合1 min，混合溶液充分振荡后形成水/分散剂/[Hmim][PF6]的乳浊液体系，于室温静置2 min，再以3500 r/min离心5 min。在离心管底部形成萃取剂液滴聚集相。用微量进样器抽取聚集相液滴至2 mL尖底塑料离心管，用甲醇溶解并定容至1 mL，取20 μL进行HPLC分析。
2.3 色谱条件
色谱柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.2%冰醋酸（45∶55）；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：250 nm；柱温：35 ℃。在该条件下，3种异黄酮类物质对照品和葛根供试品色谱图见图1。
2.7 精密度试验
将同一对照品溶液连续进样6次，以3种物质的峰面积为对象，计算其相对标准偏差，结果葛根素、大豆苷、大豆苷元峰面积的RSD分别为 1.62%、1.81%、1.19%，表明仪器精密度良好。
2.8 重复性试验
精密称取同一批葛根药材细粉5份，每份0.1 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样分析，测定峰面积，计算含量，测得葛根素、大豆苷和大豆苷元RSD分别为2.19%、1.68%和2.62%，表明该方法具有良好的重复性。
2.9 稳定性试验
精密称取葛根细粉0.1 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在室温放置0、4、8、12、24、48 h后进样，测得葛根素、大豆苷和大豆苷元峰面积RSD分别为1.88%、2.31%和3.36%，表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.10 加样回收率试验
精密称取葛根细粉9份，每份0.1 g，分别加入低、中、高3个浓度的混合对照品溶液，每个浓度3份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表2。
3 讨论
本研究参照文献[4]，检测波长选择250 nm，通过测定样品发现该波长时杂质峰的干扰较少。
试验比较了不同流动相溶液的分离效果，结果显示，采用甲醇-磷酸溶液作为流动相时，虽能使各组分峰分离，但无论怎样调节磷酸比例，峰形始终较宽；当采用甲醇-冰醋酸溶液作为流动相时，各组分峰分离较好，通过调节冰醋酸的浓度，发现其比例为0.2%时，各组分峰峰形良好，且在测定实际样品时与其他杂质分离也较好。
本研究建立了ILDLPME结合HPLC快速有效地同时测定葛根样品中3种异黄酮类物质的方法，该方法准确度高，检测限低，能将葛根中含量较低的大豆苷和大豆苷元检测出来，满足分析要求。在优化的试验条件下，3种化合物的萃取率高，分离完全，整个提取过程中仅采用少量甲醇作分散剂，从而大大减少了有机溶剂的消耗，既降低了成本又减少了环境污染及对人体的伤害，可作为葛根样品中异黄酮类物质常规检测分析方法，为中草药异黄酮类化合物的提取提供了参考。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：312.
[2] 巩红岩，秦元旭，王更富，等.葛根素对大鼠体外循环后心肌缺血再灌注损伤的保护作用及抗氧化应激机制的探讨[J].中国实验方剂学杂志， 2012，18（1）：165-168.
[3] 尹丽红，李艳枫，孟繁琳.葛根的化学成分、药理作用和临床应用[J].黑龙江医药，2010，23（3）：371-372.
[4] 宋丽军，谭晓梅，罗佳波.RP-HPLC同时测定葛根异黄酮提取部位中葛根素、大豆苷、染料木苷和大豆苷元的含量[J].药物分析杂志，2009，29（6）：968-970.
[5] 赖红梅，邢君宇.HPLC法同时测定葛根食品中葛根素，大豆苷，染料木苷，大豆素，染料木素的含量[J].中国卫生检验杂志，2010，20（8）：1899- 1901.
[6] 金文姗，谈钰元，陈有根，等.高效液相色谱法测定不同产地葛根中葛根素、大豆苷及大豆苷元的含量[J].中国中药杂志，2003，28（1）：49-51.
[7] 孙硕，翟玉娟，孙烨，等.离子液体-非极性溶剂微波提取法在人参化学成分研究中的应用[J].高等学校化学学报，2010，31（3）：468-472.
[8] 王倩，卜玮，陈璇，等.离子液体分散液相微萃取对苯丙烯酸类化合物的浓缩及作用机制[J].高等学校化学学报，2012，33（4）：700-706.
[9] Wang JJ， Pei YC， Zhao Y， et al. Recovery of amino acids by imidazolium based ionic liquids from aqueous media[J]. Green Chem， 2005，7：196-202.
[10] Visser AE， Swatloski RP， Rogers RD. pH-Dependent partitioning in room temperature ionic liquids provides a link to traditional solvent extraction behavior[J]. Green Chem，2000，2：1-4.
（收稿日期：2014-03-28；编辑：陈静）
关键词：葛根；葛根素；大豆苷；大豆苷元；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）10-0067-04
Abstract：Objective To develop a sensitive and specific HPLC method to simultaneously determine the contents of puerarin， daidzin and daidzein in Puerariae Lobatae Radix. Methods The three compounds were obtained by ionic liquid based on dispersive liquid phase microextraction. The determination was carried out on a Phenomenex C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） with a mixture of methanol-0.2% acetic acid （volume ration 45∶55） as mobile phase at a flow rate of 0.8 mL/min. The UV detective wavelength was 250 nm， and the column temperature was set at 35 ℃. Results The linear response ranged from 6.24×10-6-37.44 μg for puerarin （r=0.999 71）， 5.44×10-6-27.20 μg for daidzin （r=0.999 85）， and 5.60×10-6-28.00 μg for daidzein （r=0.999 94）， respectively. Conclusion The method is quick， simple and repeatable for simultaneous determination of the contents of puerarin， daidzin and daidzein in Puerariae Lobatae Radix.
Key words：Puerariae Lobatae Radix；puerarin；daidzin；daidzein；HPLC
葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata （Willd.） Ohwi的干燥根，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻作用，用于治疗外感发热头痛、项背强痛、口渴、麻疹不透、泄泻等[1]。现代研究表明，葛根中的主要有效成分为葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类化合物，具有降低血管阻力、改善心脑血液循环、减慢心率、降低心肌耗氧量、抑制动脉硬化、抗肿瘤、神经组织保护等作用[2-3]。因此，对葛根中异黄酮类物质的测定具有重要的临床意义。目前，葛根中葛根素、大豆苷、大豆苷元的测定报道较多[4-6]，但这些测定在前处理方法上基本采用传统的有机溶剂乙醇作提取剂，溶剂易挥发，且大量使用会对人体造成伤害。本试验采用离子液体分散液相微萃取法（ionic liquid based dispersive liquid phase microextraction，ILDLPME）对目标物进行提取，以期减少有机溶剂的使用。
ILDLPME是基于离子液体、分散剂和水的三元混合溶剂体系的样品前处理方法。离子液体具有不易挥发、性质稳定、蒸气压低及对有机物有良好的溶解性等优点，作为“绿色溶剂”在萃取分离领域得到了广泛的应用[7-8]。本试验研究异黄酮类化合物分散液相微萃取行为并对葛根中异黄酮类物质进行提取、分离，结合高效液相色谱法（HPLC），快速测定其中的葛根素、大豆苷、大豆苷元含量。
1 仪器与试药
LC-20AT液相色谱输液泵、SPD-20A紫外检测器、CTO-10AS柱温箱、LC-Solution色谱数据处理系统，日本岛津公司；KH-3200B型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；TGL-16G高速离心机，上海安亭科学仪器厂；SZ-2自动双重纯化水蒸馏器，上海泸西分析仪器；FA2004A型分析天平，上海云祥电子有限公司。
葛根素、大豆苷、大豆苷元对照品（纯度均≥98.5%，上海晶纯实业有限公司）；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（1-Butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate，[Bmim][PF6]，纯度97%）， 1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（1-Hexyl-3- methylimidazolium hexafluorophosphate，[Hmim]
[PF6]，纯度97%），1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（1-octyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate， [Omim][PF6]，纯度97%），上海成捷化学有限公司；甲醇、乙醇、冰醋酸均为分析纯，重庆川东化工有限公司化学试剂厂；磷酸，分析纯，成都市科龙化工试剂厂；二次蒸馏水，实验室自制。葛根饮片购自当地药房，经西南大学周光明教授鉴定为豆科植物野葛Pueraria lobata （Willd.） Ohwi的干燥根。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
分别精密称取葛根素、大豆苷、大豆苷元对照品，甲醇超声溶解，配制成葛根素2340 μg/mL、大豆苷2040 μg/mL、大豆苷元2100 μg/mL的对照品母液。再分别准确吸取3种对照品母液适量，用流动相配制成一系列不同浓度的混合对照品溶液，0.45 μm有机滤膜过滤，4 ℃冰箱保存备用。
2.2 供试品溶液的制备和分散液相微萃取操作方法
称取0.10 g葛根样品，用纯水对样品其进行超声处理（150 W，40 kHz）30 min，制备成供试品溶液，经0.45 μm有机滤膜过滤，4 ℃冰箱保存备用。
移取5 mL供试品溶液至5 mL带塞的尖底离心试管中，快速注入300 μL[Hmim][PF6]萃取剂和0.5 mL甲醇分散剂，涡漩混合1 min，混合溶液充分振荡后形成水/分散剂/[Hmim][PF6]的乳浊液体系，于室温静置2 min，再以3500 r/min离心5 min。在离心管底部形成萃取剂液滴聚集相。用微量进样器抽取聚集相液滴至2 mL尖底塑料离心管，用甲醇溶解并定容至1 mL，取20 μL进行HPLC分析。
2.3 色谱条件
色谱柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.2%冰醋酸（45∶55）；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：250 nm；柱温：35 ℃。在该条件下，3种异黄酮类物质对照品和葛根供试品色谱图见图1。
2.7 精密度试验
将同一对照品溶液连续进样6次，以3种物质的峰面积为对象，计算其相对标准偏差，结果葛根素、大豆苷、大豆苷元峰面积的RSD分别为 1.62%、1.81%、1.19%，表明仪器精密度良好。
2.8 重复性试验
精密称取同一批葛根药材细粉5份，每份0.1 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样分析，测定峰面积，计算含量，测得葛根素、大豆苷和大豆苷元RSD分别为2.19%、1.68%和2.62%，表明该方法具有良好的重复性。
2.9 稳定性试验
精密称取葛根细粉0.1 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在室温放置0、4、8、12、24、48 h后进样，测得葛根素、大豆苷和大豆苷元峰面积RSD分别为1.88%、2.31%和3.36%，表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.10 加样回收率试验
精密称取葛根细粉9份，每份0.1 g，分别加入低、中、高3个浓度的混合对照品溶液，每个浓度3份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表2。
3 讨论
本研究参照文献[4]，检测波长选择250 nm，通过测定样品发现该波长时杂质峰的干扰较少。
试验比较了不同流动相溶液的分离效果，结果显示，采用甲醇-磷酸溶液作为流动相时，虽能使各组分峰分离，但无论怎样调节磷酸比例，峰形始终较宽；当采用甲醇-冰醋酸溶液作为流动相时，各组分峰分离较好，通过调节冰醋酸的浓度，发现其比例为0.2%时，各组分峰峰形良好，且在测定实际样品时与其他杂质分离也较好。
本研究建立了ILDLPME结合HPLC快速有效地同时测定葛根样品中3种异黄酮类物质的方法，该方法准确度高，检测限低，能将葛根中含量较低的大豆苷和大豆苷元检测出来，满足分析要求。在优化的试验条件下，3种化合物的萃取率高，分离完全，整个提取过程中仅采用少量甲醇作分散剂，从而大大减少了有机溶剂的消耗，既降低了成本又减少了环境污染及对人体的伤害，可作为葛根样品中异黄酮类物质常规检测分析方法，为中草药异黄酮类化合物的提取提供了参考。
参考文献：
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[4] 宋丽军，谭晓梅，罗佳波.RP-HPLC同时测定葛根异黄酮提取部位中葛根素、大豆苷、染料木苷和大豆苷元的含量[J].药物分析杂志，2009，29（6）：968-970.
[5] 赖红梅，邢君宇.HPLC法同时测定葛根食品中葛根素，大豆苷，染料木苷，大豆素，染料木素的含量[J].中国卫生检验杂志，2010，20（8）：1899- 1901.
[6] 金文姗，谈钰元，陈有根，等.高效液相色谱法测定不同产地葛根中葛根素、大豆苷及大豆苷元的含量[J].中国中药杂志，2003，28（1）：49-51.
[7] 孙硕，翟玉娟，孙烨，等.离子液体-非极性溶剂微波提取法在人参化学成分研究中的应用[J].高等学校化学学报，2010，31（3）：468-472.
[8] 王倩，卜玮，陈璇，等.离子液体分散液相微萃取对苯丙烯酸类化合物的浓缩及作用机制[J].高等学校化学学报，2012，33（4）：700-706.
[9] Wang JJ， Pei YC， Zhao Y， et al. Recovery of amino acids by imidazolium based ionic liquids from aqueous media[J]. Green Chem， 2005，7：196-202.
[10] Visser AE， Swatloski RP， Rogers RD. pH-Dependent partitioning in room temperature ionic liquids provides a link to traditional solvent extraction behavior[J]. Green Chem，2000，2：1-4.
（收稿日期：2014-03-28；编辑：陈静）