【摘 要】
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目的 制备抗重症急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）多克隆抗体和抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N蛋白）单克隆抗体，建立针对SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法，并对该方法进行验证。方法 将SARS-CoV-2灭活病毒纯化抗原免疫
【基金项目】
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国家科技攻关计划（2020YFC0842100）； 湖北省重点研发计划（2020BCB041）； 湖北省科技重大专项（2021ACB005）；
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目的 制备抗重症急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）多克隆抗体和抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N蛋白）单克隆抗体，建立针对SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法，并对该方法进行验证。方法 将SARS-CoV-2灭活病毒纯化抗原免疫日本大耳白兔制备兔多克隆抗体；免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞株，经蚀斑减少中和试验（plaque reduction neutralization test,PRNT）和间接ELISA法筛选获得抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体。采用过碘酸钠氧化法对单克隆抗体5E11进行标记，偶联HRP分子，用方阵滴定法对包被抗体（50～800 ng/孔）和酶标抗体（1∶500～1∶8 000）的工作浓度进行优化，建立SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法，确定方法线性范围和最低检测限，并对其准确度、精密度、耐用性、特异性进行验证。用建立的方法检测3批SARS-CoV-2灭活疫苗工艺过程阶段样品中N蛋白抗原含量。结果 选择高效价的SARS-CoV-2兔抗血清纯化后的多克隆抗体作为包被抗体，特异性强的单克隆抗体5E11作为酶标抗体，包被抗体最佳工作浓度为100 ng/孔，酶标抗体最佳工作浓度为1∶1 000，建立了针对SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法。该方法在1.6～200 WU/mL范围内，抗原含量与对应的A450/A630呈良好的线性关系，R2＞ 0.99，最低检出限为1.6 WU/mL；高、中、低（100、50、25 WU/mL）浓度SARS-CoV-2内部参考品检测均值回收率分别为104.33%、101.33%和98.67%,CV分别为7.06%、7.47%和12.39%；重复性验证CV为8.54%，中间精密度验证CV为8.37%；耐用性验证回收率在88%～112%之间；该方法可特异性识别SARS-CoV-2全病毒Virion、重组N蛋白，与其他抗原均无交叉反应。结论 成功建立了SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法，该方法具有良好的线性相关性，准确度、精密度、特异性良好，可用于SARS-CoV-2灭活疫苗中N蛋白抗原含量的检测。
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