【摘 要】
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目的构建新型冠状病毒（SARS-CoV-2）假病毒，优化假病毒制备条件并应用于中和抗体活性检测。方法优化合成SARS-CoV-2刺突蛋白（S）基因，通过无缝克隆技术构建到表达质粒pcDNA3.1上，再与骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染293T细胞进行假病毒包装；优化质粒共转染比例，测定假病毒滴度，通过Westernblot检测S基因的表达；用共感染上清液分别感染Vero、Huh7.5、
【机 构】
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汕头大学医学院粤港新发传染病联合实验室教育部病毒学与新发传染病国际合作联合实验室
【基金项目】
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广东省科技计划项目（No.2020B1111340076）； 深圳市科技计划项目（No.JSGG20200225150702770）； 深圳湾实验室开放课题（No.SZBL202002271003）； 广东省基础与应用基础研究基金（No.2020A1515010977）；
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目的构建新型冠状病毒（SARS-CoV-2）假病毒，优化假病毒制备条件并应用于中和抗体活性检测。方法优化合成SARS-CoV-2刺突蛋白（S）基因，通过无缝克隆技术构建到表达质粒pcDNA3.1上，再与骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染293T细胞进行假病毒包装；优化质粒共转染比例，测定假病毒滴度，通过Westernblot检测S基因的表达；用共感染上清液分别感染Vero、Huh7.5、A549-hACE2和293T-hACE2细胞，比较假病毒在四种不同细胞株中的感染活性；应用定量ELISA检测接种新冠灭活疫苗第一针和第二针后血清中新型冠状病毒IgG抗体的滴度，同时应用假病毒中和实验对接种新冠疫苗后血清中和抗体活性进行评价。结果成功构建了整合SARS-CoV-2S基因的表达载体pcDNA3.1-S，确定pNL4-3.Luc.R-E-∶pcDNA3.1-S最佳转染比例为2∶1，可成功包装出高滴度的假病毒粒子。Westernblot结果表明S蛋白已成功地在假病毒中进行表达。SARS-CoV-2假病毒可感染Vero、Huh7.5、A549-hACE2和293T-hACE2等4种靶细胞，表明所构建的假病毒具有感染活力，且具有广泛的宿主范围，其中293T-hACE2细胞感染假病毒后相对其他细胞株可检测出更高的萤火虫荧光素酶活性。ELISA检测接种新冠疫苗后收集的血清，结果表明接种第二针灭活疫苗一周后可检测出较高血清IgG滴度（S/CO=10.27±3.33），半年后血清IgG滴度显著降低（S/CO=2.36±2.25）；假病毒中和实验结果表明1例IgG阳性（S/CO=10.32）免疫后血清可有效抑制SARS-CoV-2假病毒的感染活力，中和效价达到1/1066。结论成功构建SARS-CoV-2 假病毒，该假病毒粒子可用于后续有关SARS-CoV-2中和抗体活性检测和疫苗接种后体液免疫效果的评价研究。
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