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摘要：采用不同浓度聚乙二醇（PEG-6000）对藏药甘青青兰进行浸种处理，研究不同浓度PEG-6000对种子萌发的影响，待幼苗长至2叶期，转至30% PEG-6000溶液中模拟干旱胁迫，探索幼苗的抗旱情况。结果表明：不同浓度的PEG-6000浸种对种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均呈下降趋势，且发芽指数和活力指数与CK差异显著，不同浓度的PEG-6000浸种对幼苗生长有促进作用。不同浓度的PEG-6000浸种后待幼苗长至2叶期时置于30% PEG-6000溶液持续水分胁迫2 d后（PT 30%）与2叶期幼苗蒸馏水持续处理2 d后（PT）相比，丙二醛含量呈下降趋势，可溶性蛋白和游离脯氨酸含量呈上升趋势，叶绿素a含量有所增加而叶绿素b含量下降，叶绿素a/b的值增大，说明PEG-6000浸种可以提升甘青青兰幼苗的抗旱能力。
关键词：PEG-6000;甘青青兰;种子萌发特性;生长指标;丙二醛;游离脯氨酸;叶绿素;水分胁迫;抗旱性
中圖分类号： S567.23 9.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2020）13-0168-04
收稿日期：2019-07-19
基金项目：西藏自治区科技计划重大专项（编号：XZ201901-GA-04）;西藏自治区科学技术研究一般项目（编号：XZ2017ZRG-22）;西藏特色农牧资源研发协同创新项目（藏药材方向）。
作者简介：尹秀（1986—），女，河南驻马店人，硕士，讲师，研究方向为药用植物分子生物学。E-mail：yinxiu111@163.com。
通信作者：禄亚洲，博士研究生，讲师，研究方向为药用植物分子生物学。E-mail：luyazhou001@126.com。唇形科青兰属甘青青兰（Dracocephalum tanguticum Maxim.）为多年生草本[1]，又称唐古特青兰，藏药名“知羊格”[2]，常在高山灌丛林地、松林边缘、砾石草坡、干燥河谷两岸生长[3-4]，其味甘、苦，性寒，具有清肝热、止血、愈疮、干黄水等作用，用于治疗肝胃热、黄水类病、血症、疮口不愈等疾病[5-6]，是青藏高原特有植物和藏医常用药材。有关甘青青兰报道较多的是对其化学成分如黄酮类[7-8]、多糖[9]、萜类[10]、挥发油[11-12]、甾类[13]等进行分析;此外，相继出现甘青青兰的形态组织[14]及显微特征[15]方面的研究;关于甘青青兰种子萌发方面的研究主要采用不同浓度的盐、聚乙二醇（PEG）、赤霉素对其种子进行处理，结果发现，不同物质对种子萌发有一定的影响作用[16-17]。
干旱是西藏西部干旱区面临的最主要的气象灾害，也是雅鲁藏布江河谷地带常见的主要气象灾害之一[18-19]。种子萌发是植物能够成苗的前提，萌发期是植物整个生活史中最重要、最脆弱的阶段，也是进行抗逆性研究的重要时期[20]。张艳福等认为，种子萌发和幼苗初期生长比其他生长阶段更容易遭受水分和光照等环境因子及其相互作用的影响，所以常以种子萌发和幼苗初期生长阶段的生长情况评价植物的抗逆性[21]。目前，PEG被较多地应用于植物种子萌发及幼苗生长对干旱胁迫的响应、植物耐旱性评价及耐旱品种的筛选培育等相关研究[22-23]，有研究表明，聚乙二醇处理对促进种子萌发和幼苗生长、提高种子活力和抗逆性有一定的作用[24]。
本试验研究不同浓度PEG-6000浸种对甘青青兰种子萌发和幼苗抗旱性的影响，探索干旱胁迫条件下幼苗的耐受性，为今后甘青青兰人工种植提供一定的理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
2018年10月于西藏农牧学院藏药材驯化基地（94°20′20″ E、29°40′4″ N）采集甘青青兰种子，晾干后挑选饱满一致的种子，2019年3月于西藏农牧学院植物生理生化实验室进行试验。
1.2试验方法
1.2.1PEG-6000预处理取出上述已挑选的种子，置于超净工作台中加入10% NaClO溶液中消毒 5 min，无菌水多次冲洗，无菌滤纸吸干多余的水分，将处理后的种子分成6份，每份50粒，分别用0、5%、10%、15%、20% PEG-6000溶液进行预处理，放入4 ℃冰箱中浸种24 h，其中隔3 h摇动试管，以利于通气，每个处理3个重复。
1.2.2种子萌发试验将预处理后的种子取出，用蒸馏水冲洗干净，将每个处理的50粒种子播种于铺有蒸馏水浸润滤纸的培养皿内，放入光照培养箱中培养，温度为（20±1）℃，光照度为1 000 lx，14 h 光照、10 h黑暗。隔天加入数滴水以便浸透滤纸，尽量避免干旱。
1.2.32叶期幼苗水分胁迫试验分别用不同浓度0、5%、10%、15%和20% PEG-6000溶液浸种24 h，待种子萌发周期结束，幼苗长至2叶期时用30% PEG-6000溶液持续处理2 d（PT 30%），对照为2叶期幼苗蒸馏水持续处理2 d（PT），2 d后取样测定抗旱相关生理指标，每个处理3个重复。
1.3相关指标的测定
1.3.1种子萌发特性的指标从种子置床之日起观察，初始发芽之日作为该处理发芽的开始期，连续3 d不再萌发时作为发芽结束期，记录萌发情况及生长情况，统计种子的发芽率、发芽指数及活力指数等数据。
发芽率=发芽种子数量/处理种子数量×100%;
发芽势=8 d正常发芽种子数/处理种子数×100%;
发芽指数（Gi）=∑（Gt/Dt）（Gt为t d的发芽数量，个;Dt为相应的发芽时间，d）;
活力指数（Vi）=Gi×Ss（Ss为平均胚根长）。
观察后16 d，取出幼苗，用直尺测量幼苗的苗高及根长，mm。
1.3.2生理生化指标分别用不同浓度0、5%、10%、15%、20% PEG-6000溶液浸种24 h，待种子萌发周期结束，幼苗长至2叶期时，每个处理设置3个重复，均放入30% PEG-6000浸透滤纸的培养皿中（PT 30%），对照组用等量的蒸馏水代替（PT），之后每天加约3 mL相应的处理液保持滤纸的湿润，2 d后取样，测定抗旱相关生理指标，3次重复。 采用硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛含量[23];采用磺基水杨酸法测定游离脯氨酸含量[24];采用考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量[25];采用乙醇提取比色法测定叶绿素含量[26]。
1.4数据分析
数据统计后采用Microsoft Excel 2003和Origin 8.6绘图，用SPSS 17.0统计软件对平均数进行多重比较。
2结果与分析
2.1不同浓度PEG-6000预处理对甘青青兰种子萌发的影响
将甘青青兰种子分别用0（CK）、5%、10%、15%、20% PEG-6000溶液处理24 h后进行培养，3 d 后开始萌发并对其进行数据统计。结果（表1）显示，CK组的萌发情况较好，随着PEG-6000浓度增大，种子发芽率、发芽势、发芽指数等呈下降趋势，其中10%和15%处理下差别不大，20%处理下对种子萌发影响较大，表明PEG-6000预处理对甘青青兰种子萌发没有促进作用，对种子萌发有轻微的抑制作用，这种现象可能是甘青青兰种子对 PEG-6000 较为敏感，较高浓度的PEG处理会使植物膜脂过氧化，导致细胞膜渗漏，因而对植物的萌发、生长产生抑制作用。
2.2不同浓度PEG-6000预处理对甘青青兰幼苗生长的影响
将甘青青兰种子用不同浓度PEG-6000溶液处理后再进行培养，由表2可见，经PEG-6000处理后会促进幼苗生长，有利于地上部分生长，而对
2.3PEG-6000处理对甘青青兰幼苗生理生化特性的影响
2.3.1PEG-6000处理对甘青青兰幼苗丙二醛含量的影响由图1可见，CK组（PT）和试验组（PT 30%）丙二醛含量相比呈下降趋势，其中10%、15%、20% 浸种后丙二醛含量分别降低20.71、24.04、30.75 nmol/g，分别较CK组降低2.25、2.5、3.21倍。可见，用15%、20% PEG-6000浸种后丙二醛含量降幅较大，表明15%、20% PEG-6000浸种减缓了水分胁迫条件下质膜的损伤和氧化，增强了幼苗的抗旱能力。
2.3.2PEG-6000处理对甘青青兰幼苗可溶性蛋白含量的影响由图2可见，与对照组（PT）相比，试验组（PT 30%）可溶性蛋白含量均呈上升趋势，15% PEG-6000浸种组可溶性蛋白含量增加 0.33 μg/g，为所有浸种处理组中可溶性蛋白增幅最大的一组。由此说明，可以通过适量浓度的PEG预处理来增加幼苗的可溶性蛋白含量，从而提高幼苗的抗渗透胁迫能力。
2.3.3PEG-6000浸种对甘青青兰幼苗游离脯氨
酸含量的影响图3表明，与对照组（PT）相比，试验组（PT 30%）幼苗叶片中游离脯氨酸的含量呈升高趋势，其中15%、20%浸种处理组游离脯氨酸含量变化较大且呈极显著差异，分别增加93.54、113.07 μg/g，表明适宜浓度的PEG-6000浸种可以提升甘青青兰幼苗在水分胁迫下的游离脯氨酸含量，从而利于幼苗在干旱环境下吸收水分抵御逆境。
2.3.4PEG-6000浸种对甘青青兰幼苗叶绿素含量的影响图4显示，与对照组（PT）相比，试验组（PT 30%）叶绿素a含量明显增加，而叶绿素b含量下降，且试验组（PT 30%）叶绿素a/b的值明显增大，且试验组叶绿素a/b的值要明显高于对照组。叶绿素a/b的值明显增大是植物对逆境环境的一种防御性适应，捕光色素叶绿素b含量的降低使得植物的光捕获减弱，活性氧产生量减少，酶的抑制和蛋白质的降解减少，使植物更加耐旱，说明 PEG-6000 浸种可以提升甘青青兰幼苗的耐旱能力。
3结论与讨论
PEG 胁迫能够影响种子活力，使种子萌发受到抑制或发芽延迟[27-29]。本试验结果表明，PEG-6000对甘青青兰种子的萌发具有明显的延缓和抑
制作用，表现为随胁迫程度的增加，种子的萌发率、发芽势、发芽指数均下降，但对幼苗生长有一定的促进作用，这可能与物种本身的特性及其环境的异质性有关。
在一定胁迫条件下，植物体内生理生化特性会发生变化，如丙二醛、游离脯氨酸、可溶性蛋白含量会提高，这是植物对逆境胁迫的一种适应性的表现，可以作为植物抗性的指标[30]。本试验通过不同浓度 PEG-6000 处理种子，待长出幼苗后置于30% PEG-6000 溶液模拟的干旱胁迫环境下，检测后发现甘青青兰与未经其干旱胁迫处理的相比，丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白含量均发生了不同程度的变化，30% PEG-6000溶液处理幼苗后，其丙二醛含量呈下降趋势，可溶性蛋白和游离脯氨酸含量呈上升趋势，叶绿素a含量有所增加而叶绿素b含量下降，叶绿素a/b的值增大，说明PEG-6000浸种可以提升甘青青兰幼苗的抗旱能力;但较高浓度PEG-6000胁迫会导致幼苗生长状况变差甚至死亡，说明甘青青兰的抗旱性不强。
参考文献：
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关键词：PEG-6000;甘青青兰;种子萌发特性;生长指标;丙二醛;游离脯氨酸;叶绿素;水分胁迫;抗旱性
中圖分类号： S567.23 9.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2020）13-0168-04
收稿日期：2019-07-19
基金项目：西藏自治区科技计划重大专项（编号：XZ201901-GA-04）;西藏自治区科学技术研究一般项目（编号：XZ2017ZRG-22）;西藏特色农牧资源研发协同创新项目（藏药材方向）。
作者简介：尹秀（1986—），女，河南驻马店人，硕士，讲师，研究方向为药用植物分子生物学。E-mail：yinxiu111@163.com。
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干旱是西藏西部干旱区面临的最主要的气象灾害，也是雅鲁藏布江河谷地带常见的主要气象灾害之一[18-19]。种子萌发是植物能够成苗的前提，萌发期是植物整个生活史中最重要、最脆弱的阶段，也是进行抗逆性研究的重要时期[20]。张艳福等认为，种子萌发和幼苗初期生长比其他生长阶段更容易遭受水分和光照等环境因子及其相互作用的影响，所以常以种子萌发和幼苗初期生长阶段的生长情况评价植物的抗逆性[21]。目前，PEG被较多地应用于植物种子萌发及幼苗生长对干旱胁迫的响应、植物耐旱性评价及耐旱品种的筛选培育等相关研究[22-23]，有研究表明，聚乙二醇处理对促进种子萌发和幼苗生长、提高种子活力和抗逆性有一定的作用[24]。
本试验研究不同浓度PEG-6000浸种对甘青青兰种子萌发和幼苗抗旱性的影响，探索干旱胁迫条件下幼苗的耐受性，为今后甘青青兰人工种植提供一定的理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
2018年10月于西藏农牧学院藏药材驯化基地（94°20′20″ E、29°40′4″ N）采集甘青青兰种子，晾干后挑选饱满一致的种子，2019年3月于西藏农牧学院植物生理生化实验室进行试验。
1.2试验方法
1.2.1PEG-6000预处理取出上述已挑选的种子，置于超净工作台中加入10% NaClO溶液中消毒 5 min，无菌水多次冲洗，无菌滤纸吸干多余的水分，将处理后的种子分成6份，每份50粒，分别用0、5%、10%、15%、20% PEG-6000溶液进行预处理，放入4 ℃冰箱中浸种24 h，其中隔3 h摇动试管，以利于通气，每个处理3个重复。
1.2.2种子萌发试验将预处理后的种子取出，用蒸馏水冲洗干净，将每个处理的50粒种子播种于铺有蒸馏水浸润滤纸的培养皿内，放入光照培养箱中培养，温度为（20±1）℃，光照度为1 000 lx，14 h 光照、10 h黑暗。隔天加入数滴水以便浸透滤纸，尽量避免干旱。
1.2.32叶期幼苗水分胁迫试验分别用不同浓度0、5%、10%、15%和20% PEG-6000溶液浸种24 h，待种子萌发周期结束，幼苗长至2叶期时用30% PEG-6000溶液持续处理2 d（PT 30%），对照为2叶期幼苗蒸馏水持续处理2 d（PT），2 d后取样测定抗旱相关生理指标，每个处理3个重复。
1.3相关指标的测定
1.3.1种子萌发特性的指标从种子置床之日起观察，初始发芽之日作为该处理发芽的开始期，连续3 d不再萌发时作为发芽结束期，记录萌发情况及生长情况，统计种子的发芽率、发芽指数及活力指数等数据。
发芽率=发芽种子数量/处理种子数量×100%;
发芽势=8 d正常发芽种子数/处理种子数×100%;
发芽指数（Gi）=∑（Gt/Dt）（Gt为t d的发芽数量，个;Dt为相应的发芽时间，d）;
活力指数（Vi）=Gi×Ss（Ss为平均胚根长）。
观察后16 d，取出幼苗，用直尺测量幼苗的苗高及根长，mm。
1.3.2生理生化指标分别用不同浓度0、5%、10%、15%、20% PEG-6000溶液浸种24 h，待种子萌发周期结束，幼苗长至2叶期时，每个处理设置3个重复，均放入30% PEG-6000浸透滤纸的培养皿中（PT 30%），对照组用等量的蒸馏水代替（PT），之后每天加约3 mL相应的处理液保持滤纸的湿润，2 d后取样，测定抗旱相关生理指标，3次重复。 采用硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛含量[23];采用磺基水杨酸法测定游离脯氨酸含量[24];采用考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量[25];采用乙醇提取比色法测定叶绿素含量[26]。
1.4数据分析
数据统计后采用Microsoft Excel 2003和Origin 8.6绘图，用SPSS 17.0统计软件对平均数进行多重比较。
2结果与分析
2.1不同浓度PEG-6000预处理对甘青青兰种子萌发的影响
将甘青青兰种子分别用0（CK）、5%、10%、15%、20% PEG-6000溶液处理24 h后进行培养，3 d 后开始萌发并对其进行数据统计。结果（表1）显示，CK组的萌发情况较好，随着PEG-6000浓度增大，种子发芽率、发芽势、发芽指数等呈下降趋势，其中10%和15%处理下差别不大，20%处理下对种子萌发影响较大，表明PEG-6000预处理对甘青青兰种子萌发没有促进作用，对种子萌发有轻微的抑制作用，这种现象可能是甘青青兰种子对 PEG-6000 较为敏感，较高浓度的PEG处理会使植物膜脂过氧化，导致细胞膜渗漏，因而对植物的萌发、生长产生抑制作用。
2.2不同浓度PEG-6000预处理对甘青青兰幼苗生长的影响
将甘青青兰种子用不同浓度PEG-6000溶液处理后再进行培养，由表2可见，经PEG-6000处理后会促进幼苗生长，有利于地上部分生长，而对
2.3PEG-6000处理对甘青青兰幼苗生理生化特性的影响
2.3.1PEG-6000处理对甘青青兰幼苗丙二醛含量的影响由图1可见，CK组（PT）和试验组（PT 30%）丙二醛含量相比呈下降趋势，其中10%、15%、20% 浸种后丙二醛含量分别降低20.71、24.04、30.75 nmol/g，分别较CK组降低2.25、2.5、3.21倍。可见，用15%、20% PEG-6000浸种后丙二醛含量降幅较大，表明15%、20% PEG-6000浸种减缓了水分胁迫条件下质膜的损伤和氧化，增强了幼苗的抗旱能力。
2.3.2PEG-6000处理对甘青青兰幼苗可溶性蛋白含量的影响由图2可见，与对照组（PT）相比，试验组（PT 30%）可溶性蛋白含量均呈上升趋势，15% PEG-6000浸种组可溶性蛋白含量增加 0.33 μg/g，为所有浸种处理组中可溶性蛋白增幅最大的一组。由此说明，可以通过适量浓度的PEG预处理来增加幼苗的可溶性蛋白含量，从而提高幼苗的抗渗透胁迫能力。
2.3.3PEG-6000浸种对甘青青兰幼苗游离脯氨
酸含量的影响图3表明，与对照组（PT）相比，试验组（PT 30%）幼苗叶片中游离脯氨酸的含量呈升高趋势，其中15%、20%浸种处理组游离脯氨酸含量变化较大且呈极显著差异，分别增加93.54、113.07 μg/g，表明适宜浓度的PEG-6000浸种可以提升甘青青兰幼苗在水分胁迫下的游离脯氨酸含量，从而利于幼苗在干旱环境下吸收水分抵御逆境。
2.3.4PEG-6000浸种对甘青青兰幼苗叶绿素含量的影响图4显示，与对照组（PT）相比，试验组（PT 30%）叶绿素a含量明显增加，而叶绿素b含量下降，且试验组（PT 30%）叶绿素a/b的值明显增大，且试验组叶绿素a/b的值要明显高于对照组。叶绿素a/b的值明显增大是植物对逆境环境的一种防御性适应，捕光色素叶绿素b含量的降低使得植物的光捕获减弱，活性氧产生量减少，酶的抑制和蛋白质的降解减少，使植物更加耐旱，说明 PEG-6000 浸种可以提升甘青青兰幼苗的耐旱能力。
3结论与讨论
PEG 胁迫能够影响种子活力，使种子萌发受到抑制或发芽延迟[27-29]。本试验结果表明，PEG-6000对甘青青兰种子的萌发具有明显的延缓和抑
制作用，表现为随胁迫程度的增加，种子的萌发率、发芽势、发芽指数均下降，但对幼苗生长有一定的促进作用，这可能与物种本身的特性及其环境的异质性有关。
在一定胁迫条件下，植物体内生理生化特性会发生变化，如丙二醛、游离脯氨酸、可溶性蛋白含量会提高，这是植物对逆境胁迫的一种适应性的表现，可以作为植物抗性的指标[30]。本试验通过不同浓度 PEG-6000 处理种子，待长出幼苗后置于30% PEG-6000 溶液模拟的干旱胁迫环境下，检测后发现甘青青兰与未经其干旱胁迫处理的相比，丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白含量均发生了不同程度的变化，30% PEG-6000溶液处理幼苗后，其丙二醛含量呈下降趋势，可溶性蛋白和游离脯氨酸含量呈上升趋势，叶绿素a含量有所增加而叶绿素b含量下降，叶绿素a/b的值增大，说明PEG-6000浸种可以提升甘青青兰幼苗的抗旱能力;但较高浓度PEG-6000胁迫会导致幼苗生长状况变差甚至死亡，说明甘青青兰的抗旱性不强。
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