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摘 要：目的：探讨三七总皂甙对局灶性脑缺血再灌注损伤的海马神经生长因子及酪氨酸激酶A含量变化的影响。方法：120只SD大鼠体重200~220g，随机分为3组：假手术组(n=40)，局灶脑缺血再灌注组(n=40)和三七总皂甙治疗组(n=40)。线栓法制备大脑中动脉梗阻（MCAO）模型，药物组在脑缺血再灌注即刻和12h腹腔注射三七总皂甙，模型组和假手术组均注射等量生理盐水。分别在缺血再灌注2h、4h、6h、12h和24h处死动物，运用RT—PCR技术检测缺血侧海马组织内NGF和TrkA的mRNA的表达变化。结果：再灌注损伤后，损伤侧海马组织内NGF和TrkA的mRNA表达均增高。在三七总皂甙治疗组中NGF和TrkA的mRNA于再灌注2h上升，4h达高峰。结论：脑缺血后损伤侧海马神经元内NGF和TrkA的mRNA含量增多，可能有利于受损神经元的修复。
关键词：局灶性脑缺血再灌注；三七总皂甙；神经生长因子；酪氨酸激酶A
中图分类号：R322.81文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）02-0026-03
现代药理研究证实三七皂苷对多种动物脑缺血及再灌注损伤有良好的保护作用，其作用机理与钙离子拮抗及抗自由基等作用有关，同时三七皂苷还具有降低血粘度、抑制血小板聚集、扩张血管、降低血脂、改善学习记忆功能及改善微循环和抗炎等作用［1，2］。
本研究拟用大鼠大脑中动脉线栓法建立缺血模型，采用RT-PCR技术，检测海马组织内NGF及TrkAmRNA含量的变化，并研究三七总皂甙对大鼠大脑中动脉栓塞后脑内NGF及TrkA含量变化的影响来阐明其对缺血性脑损伤的神经元保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料
成年SD大鼠，雌雄各半，体量220～250g，由昆明医学院实验动物中心提供。三七总皂甙注射液(批号：ZZ-5559，商品名：脑明注射液)。TRIZOL试剂（Molecular Research Center），逆转录试剂盒Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas Company)，PCR试剂盒PCR Master Mix Kit（Fermentas Company），DNA Ladder Marker 2000，DNA上样缓冲液(大连宝生物)，TRIZOL(Molecular Reseach Center)。兔抗NGF多克隆抗体(Chemicon)，兔抗TrkA多克隆抗体(博士德生物工程有限公司)， 二步法免疫组化检测试剂盒PV-9000(北京中杉)，浓缩型DAB试剂盒(北京中杉)。
1.2 方法
1.2.1 动物分组
随机分成3组：假手术组(sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、三七总皂甙治疗组(PNS组).每组根据再灌注时间不同再分为2h、4h、6h、12h和24h 5个亚组，每亚组8只动物。
1.2.2 模型制作
参考Longa［3］的线栓法，造成右侧大脑中动脉供血区的缺血；2h后拔出线栓恢复再灌注，并缝扎切口。假手术组仅分离血管而不插线栓。三七组在拔出线栓后立即经腹腔注射皂苷注射液(2mL ip)，随之每隔12h用药1次［5］。缺血再灌注组及假手术组注射相当剂量的生理盐水。
1.2.3 RT-PCR技术检测
实验动物在术后各时间点，活体取损伤侧脑皮质组织约100mg，TRIZOL试剂提取总RNA。取4μg的总RNA用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，操作按照试剂盒说明书进行，反应条件是94℃ 45s，退火温度见表1所示45s，72℃ 1min，各基因的引物序列、最佳退火温度及扩增产物大小如下表所示，引物由大连宝生物公司合成。PCR产物取20μL用含0.5μg/mL EB的1%琼脂糖凝胶电泳，BIO-RAD凝胶成像仪紫外模式下分析凝胶图片。
1.2.4 统计学处理
组内比较采用单因素方差分析；各组间的比较采用t检验。统计软件选用SPSS 11.5。
2 结果
2.1 NGF和TrkA在各组中mRNA的表达变化
2.1.1 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性
RNA样品1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳条带，可见28S、18S条带，说明所提取RNA样品完整，可以用于逆转录(图1)。
2.1.2 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的结果
在各组中均有β-actin、NGF和TrkA mRNA的表达，得到目的基因片段。1%琼脂糖凝胶电泳观察到特异性扩增条带，大小分别为227 bp、479bp和824bp，与预期的片段长度一致（见图2~4）。
图例说明：1：DL2000 DNA Marker；2：再灌组2h组；3：再灌组4h组；4：再灌组6h组；5：再灌组12h组；6：再灌组24h组
2.1.3 图片灰度扫描结果
对图片进行灰度扫描。以β-actin灰度值为参照，求得各组的NGF和TrkA与β-actin的相对比值。数据用均数±标准差(±s)表示（见表2）。结果显示：再灌注损伤后，海马组织内NGF和TrkA的mRNA表达均增高，与假手术组比较有统计学意义（P<0.05）。在三七总皂甙治疗组中NGF的mRNA于再灌注2h上升，4h达高峰，与假手术组和缺血再灌注组比较有统计学意义（P<0.05）。而缺血再灌注组NGF的mRNA于再灌注6h达到高峰。TrkA mRNA的表达在灌注2h也明显升高，同时也在4h达到高峰（P<0.05），与假手术组和缺血再灌注组比较有统计学意义（P<0.05），而缺血再灌注组TrkA的mRNA亦于再灌注6h达到高峰。
3 讨论
NGF是神经营养因子家族成员之一，神经营养因子不仅调节发育过程中神经元的存活，而且能够阻止成年神经元损伤后神经元的死亡等许多神经系统功能。高亲和力NGF受体trkA被公认为是NGF的功能性受体，是启动传递NGF生物效应的信息物质。当NGF与trkA结合后，受体细胞外区构象变化，使受体细胞内区的酪氨酸激酶活性增强。其作用途径，首先可通过提高神经元表面的NGF受体TrkA的表达［4］，对神经元产生生物效应；还可以通过活化NGF受体TrkA，在细胞内阻断损伤因子［5］，从而保护神经元免受缺血性损伤，缩小梗死体积，且促进损伤后神经组织的修复，减轻和改善患者症状。
三七总皂苷是从我国名贵中药三七中提取的有效活性成分，能改善微循环、抗炎、抑制NO、兴奋性氨基酸和脂质过氧化等，可能还与NGF的表达增加有关。研究表明［6］：NGF、TrkA对维持损伤神经元的结构、促进神经生长和修复具有重要作用，脑缺血损伤后应用外源性神经营养不仅可减轻神经元损伤，而且可促进运动、感觉轴突再生和神经功能的恢复。
短暂的全脑缺血过程能引起海马CA1区锥体细胞在缺血后数天发生死亡，而顶叶皮层，海马CA3区和齿状回颗粒细胞(DGCs)等对这种缺血有一定耐受性。本研究结果显示：NGF和TrkA mRNA在假手术组有一定的表达，在局灶缺血再关注后，海马组织内NGF和TrkA mRNA表达增加。三七总皂甙治疗组相应时间点两项指标增加更明显，表明三七总皂甙治疗可以提高大脑海马内源性NGF和TrkA的表达。本研究说明，三七总皂甙可使NGF、TrkA的mRNA表达上调，从而促使受损伤海马组织内NGF、TrkA蛋白的表达，提示三七总皂甙可以减轻缺血后继发性损伤的机制还可能与NGF和TrkA表达量增加有关。
综上所述，三七总皂苷通过上调大鼠脑缺血再灌注损伤时海马部位NGF和TrkA mRNA含量，从而促进损伤神经元的修复和对抗脑缺血后产生的损害因子，避免脑缺血再灌注损伤后海马神经元的死亡和凋亡，从而发挥其对脑缺血损伤的治疗作用，且在起效时间和作用持续时间上均强于缺血再灌注组。
参考文献：
［1］ Hou AH. Clinical application and experimental study of pseudoginseng［J］. InfTradit ChinMed，1999，16(6)：21-24.
［2］ 刘建辉，冀凤云，王婷，等. 三七总皂苷对脑缺血再灌注损伤保护作用的实验研究［J］.中国临床神经科学， 2002，10(1)：90.
［3］ Longa E Z，Weinstein P R， Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke， 1989， 20(1)：84-91.
［4］ 屈泽强，谢智光，王乃平，等.三七总皂苷抗衰老作用的实验研究［J］.广州中医药大学学报，2005，22(2)：130-133.
［5］ Ron D and Habener JF. CHOP， a novel developmentally regulated nuclear protein that dimerizes with transcription factors C/EBP and LAP and functions as a dominant-negative inhibitor of gene transcription［J］. GenesDev，2002，6：439-453.
［6］ Levi-Montalcini R.The nerve growth factor 35 years later［J］.Science，1987， 237： 1154-1162.
（责任编辑：姜付平）
关键词：局灶性脑缺血再灌注；三七总皂甙；神经生长因子；酪氨酸激酶A
中图分类号：R322.81文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）02-0026-03
现代药理研究证实三七皂苷对多种动物脑缺血及再灌注损伤有良好的保护作用，其作用机理与钙离子拮抗及抗自由基等作用有关，同时三七皂苷还具有降低血粘度、抑制血小板聚集、扩张血管、降低血脂、改善学习记忆功能及改善微循环和抗炎等作用［1，2］。
本研究拟用大鼠大脑中动脉线栓法建立缺血模型，采用RT-PCR技术，检测海马组织内NGF及TrkAmRNA含量的变化，并研究三七总皂甙对大鼠大脑中动脉栓塞后脑内NGF及TrkA含量变化的影响来阐明其对缺血性脑损伤的神经元保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料
成年SD大鼠，雌雄各半，体量220～250g，由昆明医学院实验动物中心提供。三七总皂甙注射液(批号：ZZ-5559，商品名：脑明注射液)。TRIZOL试剂（Molecular Research Center），逆转录试剂盒Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas Company)，PCR试剂盒PCR Master Mix Kit（Fermentas Company），DNA Ladder Marker 2000，DNA上样缓冲液(大连宝生物)，TRIZOL(Molecular Reseach Center)。兔抗NGF多克隆抗体(Chemicon)，兔抗TrkA多克隆抗体(博士德生物工程有限公司)， 二步法免疫组化检测试剂盒PV-9000(北京中杉)，浓缩型DAB试剂盒(北京中杉)。
1.2 方法
1.2.1 动物分组
随机分成3组：假手术组(sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、三七总皂甙治疗组(PNS组).每组根据再灌注时间不同再分为2h、4h、6h、12h和24h 5个亚组，每亚组8只动物。
1.2.2 模型制作
参考Longa［3］的线栓法，造成右侧大脑中动脉供血区的缺血；2h后拔出线栓恢复再灌注，并缝扎切口。假手术组仅分离血管而不插线栓。三七组在拔出线栓后立即经腹腔注射皂苷注射液(2mL ip)，随之每隔12h用药1次［5］。缺血再灌注组及假手术组注射相当剂量的生理盐水。
1.2.3 RT-PCR技术检测
实验动物在术后各时间点，活体取损伤侧脑皮质组织约100mg，TRIZOL试剂提取总RNA。取4μg的总RNA用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，操作按照试剂盒说明书进行，反应条件是94℃ 45s，退火温度见表1所示45s，72℃ 1min，各基因的引物序列、最佳退火温度及扩增产物大小如下表所示，引物由大连宝生物公司合成。PCR产物取20μL用含0.5μg/mL EB的1%琼脂糖凝胶电泳，BIO-RAD凝胶成像仪紫外模式下分析凝胶图片。
1.2.4 统计学处理
组内比较采用单因素方差分析；各组间的比较采用t检验。统计软件选用SPSS 11.5。
2 结果
2.1 NGF和TrkA在各组中mRNA的表达变化
2.1.1 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性
RNA样品1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳条带，可见28S、18S条带，说明所提取RNA样品完整，可以用于逆转录(图1)。
2.1.2 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的结果
在各组中均有β-actin、NGF和TrkA mRNA的表达，得到目的基因片段。1%琼脂糖凝胶电泳观察到特异性扩增条带，大小分别为227 bp、479bp和824bp，与预期的片段长度一致（见图2~4）。
图例说明：1：DL2000 DNA Marker；2：再灌组2h组；3：再灌组4h组；4：再灌组6h组；5：再灌组12h组；6：再灌组24h组
2.1.3 图片灰度扫描结果
对图片进行灰度扫描。以β-actin灰度值为参照，求得各组的NGF和TrkA与β-actin的相对比值。数据用均数±标准差(±s)表示（见表2）。结果显示：再灌注损伤后，海马组织内NGF和TrkA的mRNA表达均增高，与假手术组比较有统计学意义（P<0.05）。在三七总皂甙治疗组中NGF的mRNA于再灌注2h上升，4h达高峰，与假手术组和缺血再灌注组比较有统计学意义（P<0.05）。而缺血再灌注组NGF的mRNA于再灌注6h达到高峰。TrkA mRNA的表达在灌注2h也明显升高，同时也在4h达到高峰（P<0.05），与假手术组和缺血再灌注组比较有统计学意义（P<0.05），而缺血再灌注组TrkA的mRNA亦于再灌注6h达到高峰。
3 讨论
NGF是神经营养因子家族成员之一，神经营养因子不仅调节发育过程中神经元的存活，而且能够阻止成年神经元损伤后神经元的死亡等许多神经系统功能。高亲和力NGF受体trkA被公认为是NGF的功能性受体，是启动传递NGF生物效应的信息物质。当NGF与trkA结合后，受体细胞外区构象变化，使受体细胞内区的酪氨酸激酶活性增强。其作用途径，首先可通过提高神经元表面的NGF受体TrkA的表达［4］，对神经元产生生物效应；还可以通过活化NGF受体TrkA，在细胞内阻断损伤因子［5］，从而保护神经元免受缺血性损伤，缩小梗死体积，且促进损伤后神经组织的修复，减轻和改善患者症状。
三七总皂苷是从我国名贵中药三七中提取的有效活性成分，能改善微循环、抗炎、抑制NO、兴奋性氨基酸和脂质过氧化等，可能还与NGF的表达增加有关。研究表明［6］：NGF、TrkA对维持损伤神经元的结构、促进神经生长和修复具有重要作用，脑缺血损伤后应用外源性神经营养不仅可减轻神经元损伤，而且可促进运动、感觉轴突再生和神经功能的恢复。
短暂的全脑缺血过程能引起海马CA1区锥体细胞在缺血后数天发生死亡，而顶叶皮层，海马CA3区和齿状回颗粒细胞(DGCs)等对这种缺血有一定耐受性。本研究结果显示：NGF和TrkA mRNA在假手术组有一定的表达，在局灶缺血再关注后，海马组织内NGF和TrkA mRNA表达增加。三七总皂甙治疗组相应时间点两项指标增加更明显，表明三七总皂甙治疗可以提高大脑海马内源性NGF和TrkA的表达。本研究说明，三七总皂甙可使NGF、TrkA的mRNA表达上调，从而促使受损伤海马组织内NGF、TrkA蛋白的表达，提示三七总皂甙可以减轻缺血后继发性损伤的机制还可能与NGF和TrkA表达量增加有关。
综上所述，三七总皂苷通过上调大鼠脑缺血再灌注损伤时海马部位NGF和TrkA mRNA含量，从而促进损伤神经元的修复和对抗脑缺血后产生的损害因子，避免脑缺血再灌注损伤后海马神经元的死亡和凋亡，从而发挥其对脑缺血损伤的治疗作用，且在起效时间和作用持续时间上均强于缺血再灌注组。
参考文献：
［1］ Hou AH. Clinical application and experimental study of pseudoginseng［J］. InfTradit ChinMed，1999，16(6)：21-24.
［2］ 刘建辉，冀凤云，王婷，等. 三七总皂苷对脑缺血再灌注损伤保护作用的实验研究［J］.中国临床神经科学， 2002，10(1)：90.
［3］ Longa E Z，Weinstein P R， Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke， 1989， 20(1)：84-91.
［4］ 屈泽强，谢智光，王乃平，等.三七总皂苷抗衰老作用的实验研究［J］.广州中医药大学学报，2005，22(2)：130-133.
［5］ Ron D and Habener JF. CHOP， a novel developmentally regulated nuclear protein that dimerizes with transcription factors C/EBP and LAP and functions as a dominant-negative inhibitor of gene transcription［J］. GenesDev，2002，6：439-453.
［6］ Levi-Montalcini R.The nerve growth factor 35 years later［J］.Science，1987， 237： 1154-1162.
（责任编辑：姜付平）