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应用搭桥PCR技术,将肿瘤坏死因子-α基因的前4位氨基酸的编码序列删除,对hTNF-α的第8/9/10/29/31/157位氨基酸的密码子进行定点突变,将突变后的cDNA插入到pBV220载体中构建重组质粒pBV220-tnf-αD4。将重组质粒转化大肠杆菌DH50t,筛选获得了高效表达TNF-αD4突变体的工程菌,表达的重组蛋白约占菌体蛋白总量的45%左右,经硫酸铵沉淀和阳离子交换层析纯化得到纯度达90%以上的重组目的蛋白,比活性达到8×10^7。用单甲氧基聚乙二醇-丁醛(mPEG-Butyr