灵芝是一种重要的药用真菌,然而由于近几年缺乏有效的反向遗传体系研究,灵芝的分子遗传相关研究进展相对缓慢。该研究建立了一种更加简便快捷的灵芝电穿孔转基因方法,利用灵芝内源乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶基因(ura3)作为反向筛选标记,构建4种沉默载体(颈环结构沉默载体,正向沉默载体,反向沉默载体以及正反双向启动子沉默载体),并基于此转基因方法实现了对灵芝内源基因的沉默。通过系统比对以上4种沉默方法,发现4种沉默方法都不同程度地下调了ura3基因的表达,其中双向启动子沉默不仅载体构建方便并且能够获得最高的沉默效率(达到81.9%)。利用这种双向启动子沉默载体以及ura3的反向筛选特性,建立了灵芝的共沉默体系,发现共沉默下基因转录的下调有一定的相关性,提高了基因沉默的筛选效率。该反向遗传体系的建立有助于深入研究灵芝中单基因或多基因的功能,推动灵芝等大型担子菌的分子遗传研究进展。