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摘要
[目的]建立甘草渣中总黄酮含量的测定方法。[方法]以芦丁作为对照品，10% KOH为显色剂，采用紫外分光光度法，在409 nm波长处对样品中的总黄酮含量进行测定。[结果]总黄酮在一定范围内呈良好的线性关系，R2为0.994 5；平均加样回收率为88%，RSD为13%，甘草渣中总黄酮的含量为2.24%。[结论]该方法稳定、简便，适用于甘草渣中总黄酮含量的测定。
关键词紫外分光光度法；甘草渣；总黄酮含量
中图分类号S567.23+9文献标识码A文章编号0517-6611（2017）09-0123-02
Determination of Total Flavonoids in Licorice Residue by UV Spectrophotometry
ZHANG Lala1， HU Haobin1，WANG Zongbo2 et al
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering， Longdong Univercity，Qingyang，Gansu 745000；2.Qingyang Zhongkai Agricultural Products Co.， Ltd.，Qingyang，Gansu 745000）
Abstract[Objective] The research aimed to establish the determination method of total flavonoids content in licorice residue. [Method]Using rutin as the reference substance and 10% KOH as the color reagent，the content of total flavonoids in the samples was measured at 409 nm by UV spectrophotometry.[Result]The total flavonoids showed a good linearity in a certain range， R2 was 0.994 5.The average recoveries were 88%， RSD was 1.3%， and the content of total flavonoids in licorice residue was 2.24%.[Conclusion] The method is stable and simple， and is suitable for the determination of total flavonoids in licorice residue.
Key wordsUV spectrophotometry；Licorice residue；Total flavonoids content
甘草是豆科蝶形花亞科甘草属多年生草本植物[1]，具有补脾益气、清热解毒等功效[2]。甘草黄酮类化合物主要存在于甘草的根、叶及其生产甘草酸的废弃物甘草渣中[3]。工业化生产中仅对甘草中的甘草甜素作为主要有效成分进行提取[4-6]，提取后所剩余的甘草渣作为工业废料弃去，这造成了很大的浪费。出于对资源的有效利用，笔者采用紫外分光光度法测定生产甘草酸的废弃物甘草渣中总黄酮含量，并考察了显色剂用量、显色时间對测定甘草渣中总黄酮含量的影响，旨在建立一种快速、简便的甘草渣中总黄酮含量的测定方法。
1材料与方法
1.1仪器
SPECORD-50型紫外分光光度仪（德国耶拿公司）；FZ102型微型植物试样粉粹机（北京中兴伟业仪器有限公司）；RE-5203型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；BS110S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；SHZ-D型循环水式真空泵（河南省巩义市英峪仪器厂）；DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒科科技有限公司）。
1.2试材
甘草渣，庆阳市中凯农产品有限责任公司提供；芦丁标准品，购自中国药品生物制品研究所；氢氧化钾，分析纯，购自西安化学试剂厂；乙醇，分析纯，购自西安化学试剂厂；无水乙醇，分析纯，购自西安化学试剂厂；去离子水。
1.3方法
1.3.1
对照品溶液的配制。精密称取105 ℃干燥恒重的芦丁对照品0.01 g，加80%乙醇溶液定容至100 mL，作为浓度为0.1 mg/mL的标准溶液。
1.3.2
样品溶液的配制。称取粉碎后过筛（60目）的甘草渣5.0 g，置250 mL容量瓶中，加80%乙醇150 mL，超声提取（功率200 W，频率40 kHz）30 min，过滤，滤渣再加入80%乙醇100 mL，超声处理20 min，过滤，合并2次滤液，冷却至室温后用80%乙醇稀释至一定量，摇匀过滤，弃去初滤液，续滤液即为样品溶液。
1.3.3
显色溶液的配制。准确吸收芦丁对照品溶液和样品溶液各1.0 mL，置于10 mL的容量瓶，分别加入0.5 mL 10% KOH溶液作为显色剂，室温放置5 min，用80%乙醇稀释至一定量，摇匀，即得对照品或样品的显色溶液。
1.3.4
最大吸收波长的选择。准确吸收芦丁对照品溶液和样品溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶，分别加入0.5 mL 10% KOH溶液作为显色剂，室温放置5 min，用80%乙醇稀释至一定量，摇匀，于300～600 nm波长处扫描，确定最大吸收波长。
1.3.5方法学考察。
1.3.5.1 线性关系考察。精确吸取0.1 mg/mL的芦丁对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于10 mL的试管中，分别加入80%乙醇5.0 mL，再加0.5 mL 10% KOH 溶液，充分摇匀显色5 min后，用80%乙醇定容至10 mL，摇匀，以不加样品的溶液为参比液，在最大吸收峰处测定其吸光度值。以吸光度（A）为纵坐标、芦丁对照品溶液的质量浓度（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线。
1.3.5.2精密度试验。取同一对照品溶液1.0 mL，按照“1.3.3”方法显色稳定5 min后连续测定吸光度5次，计算RSD。
1.3.5.3
稳定性试验。精密量取样品溶液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，按“1.3.3”方法显色后，分别在80 min内每10 min在最大波长处测定吸光度。
1.3.5.4
重复性试验。取同一批甘草渣粉末6份，精密称定，按“1.3.2”方法制备样品溶液，按照“1.3.5.1”方法测定吸光度。
1.3.5.5
加样回收试验。分别准确量取已知总黄酮含量为0.023 mg/mL的1 mL提取液6份，分别加入一定量的蘆丁标准品，按“1.3.5.1”方法测定吸光度，计算加样回收率。
1.3.6
样品总黄酮含量的测定。精密吸取样品溶液3份，每份均为0.5 mL，按“1.3.4”方法于最大波长处测定吸光度，将试样的吸光度平均值带入标准曲线方程，计算样品中总黄酮含量。
2结果与分析
2.1显色剂用量的确定
准确移取1.0 mL样液于10 mL容量瓶，分别加不同用量（0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL）的显色剂（10% KOH溶液），室温放置5 min，用80%乙醇定容，摇匀；用加样品不加显色液的溶液作空白对照，在最大波长处测定其吸光度（3个平行）。以吸光度（A）为纵坐标、KOH用量（mg/mL）为横坐标绘制曲线（图1）。
图1显色剂用量与吸光度的关系
Fig.1The relationship between the dosages of chromogenic agent and absorbance
由图1可知，随着显色剂用量的增加，吸光度逐渐增大，这是因为显色剂与样品溶液发生反应所致；当显色剂用量>0.5 mL后，吸光度又开始减小，而后，随着显色剂用量的增
加，样品溶液所需的显色剂量达到饱和，吸光度变化幅度不
太明显，再随着显色剂量的增加，吸光度发生突跃。由于显色剂的用量是在最大波长处测量，且鉴于方便和节约时间考虑，故选择0.5 mL为最佳显色剂用量。
2.2显色时间的确定
准确移取1.0 mL样液于10 mL容量瓶，精密加入0.5 mL的显色剂（10%氢氧化钾溶液），室温放置不同时间（0、2、5、10、20、30、60 min ）后，用80%乙醇定容，摇匀；用80%乙醇作空白对照，在最大波长处测定其吸光度（3个平行）。以吸光度（A）为纵坐标、时间（min）为横坐标绘制曲线（图2）。
由图2可知，随着显色时间的增加，吸光度逐渐增大，这是因为随着时间的增加，样品溶液与显色剂间的反应进行的比较充分；当显色时间>5 min后，样品溶液与显色剂间的反应进行完全，吸光度基本没有变化，再随着显色时间的增加，吸光度增加，而后随着显色时间的增加，吸光度变化不太明显。由于显色时间是在最大波长处测量，且鉴于方便和节约时间考虑，故选择5 min为最佳显色时间。
2.3最大吸收波长的选择
由图3可知，对照品显色溶液与样品显色溶液最大吸收波长很接近，故选择409 nm为试验的测定波长。
2.4方法学考察
2.4.1
标准曲线的绘制。按照“1.3.5.1”方法操作，以吸光度（A）为纵坐标、芦丁对照品溶液的质量浓度（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线（图4），得线性回归方程：y=32.336x-0.012 9（R2=0.994 5），表明该试验方法相对来说比较合理，所得曲线较为理想。
2.4.2
精密度试验。同一份样品连续5次进样，吸光度的RSD为1.7%，表明仪器精密度良好。
2.4.3稳定性试验。按照“1.3.5.3”操作，结果发现吸光度随时间的变化而变化，到一定时间后趋于稳定。计算RSD为1.3%，表明供试品溶液在80 min内稳定性良好。
2.4.4重复性试验。按照“1.3.5.4”操作，计算得出6份样品总黄酮含量的RSD为1.6%，表明该方法重复性良好。
2.4.5
加样回收率试验。由表1可知，甘草渣中总黄酮的平均加樣回收率为88%，RSD为1.3%，说明该方法的加样回收率较高。
2.5样品含量测定按“1.3.6”的方法，计算样品中总黄酮的含量为2.24%。
3小结
以80%乙醇为提取溶剂，10%KOH为显色剂，采用紫外分光光度法测定甘草渣中总黄酮含量；并且考察了显色时间
和显色剂用量。结果表明，总黄酮含量最高时的最佳显色时
间为5 min，显色剂用量为0.5 mL，试剂乙醇浓度为80%，最大吸收峰在409 nm波长处；此时甘草渣中总黄酮的含量为224%。
参考文献
[1] 谷会岩.中国甘草资源生态学研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2001.
[2] 郑虎占，董泽宏，佘靖.中药现代研究与应用[M].北京：学苑出版社，1997： 1256-1279.
[3] 崔永明.甘草次生代谢产物分离纯化研究[D].武汉：华中科技大学，2005.
[4] 乔仲和，胡自如.甘草渣中大量黄酮类化合物的分离及甘草的综合开发研究[J].中草药，1997，28（9）： 522-524.
[5] 吴伟康，奉建芳，黄小蕊，等.甘草提取工艺的初步研究[J].中草药，2001，32（3）： 211-212.
[6] 封士兰.甘草黄酮的提取分离和含量测定[J].兰州医学院学报，1998，24（4）： 20-21.
[目的]建立甘草渣中总黄酮含量的测定方法。[方法]以芦丁作为对照品，10% KOH为显色剂，采用紫外分光光度法，在409 nm波长处对样品中的总黄酮含量进行测定。[结果]总黄酮在一定范围内呈良好的线性关系，R2为0.994 5；平均加样回收率为88%，RSD为13%，甘草渣中总黄酮的含量为2.24%。[结论]该方法稳定、简便，适用于甘草渣中总黄酮含量的测定。
关键词紫外分光光度法；甘草渣；总黄酮含量
中图分类号S567.23+9文献标识码A文章编号0517-6611（2017）09-0123-02
Determination of Total Flavonoids in Licorice Residue by UV Spectrophotometry
ZHANG Lala1， HU Haobin1，WANG Zongbo2 et al
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering， Longdong Univercity，Qingyang，Gansu 745000；2.Qingyang Zhongkai Agricultural Products Co.， Ltd.，Qingyang，Gansu 745000）
Abstract[Objective] The research aimed to establish the determination method of total flavonoids content in licorice residue. [Method]Using rutin as the reference substance and 10% KOH as the color reagent，the content of total flavonoids in the samples was measured at 409 nm by UV spectrophotometry.[Result]The total flavonoids showed a good linearity in a certain range， R2 was 0.994 5.The average recoveries were 88%， RSD was 1.3%， and the content of total flavonoids in licorice residue was 2.24%.[Conclusion] The method is stable and simple， and is suitable for the determination of total flavonoids in licorice residue.
Key wordsUV spectrophotometry；Licorice residue；Total flavonoids content
甘草是豆科蝶形花亞科甘草属多年生草本植物[1]，具有补脾益气、清热解毒等功效[2]。甘草黄酮类化合物主要存在于甘草的根、叶及其生产甘草酸的废弃物甘草渣中[3]。工业化生产中仅对甘草中的甘草甜素作为主要有效成分进行提取[4-6]，提取后所剩余的甘草渣作为工业废料弃去，这造成了很大的浪费。出于对资源的有效利用，笔者采用紫外分光光度法测定生产甘草酸的废弃物甘草渣中总黄酮含量，并考察了显色剂用量、显色时间對测定甘草渣中总黄酮含量的影响，旨在建立一种快速、简便的甘草渣中总黄酮含量的测定方法。
1材料与方法
1.1仪器
SPECORD-50型紫外分光光度仪（德国耶拿公司）；FZ102型微型植物试样粉粹机（北京中兴伟业仪器有限公司）；RE-5203型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；BS110S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；SHZ-D型循环水式真空泵（河南省巩义市英峪仪器厂）；DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒科科技有限公司）。
1.2试材
甘草渣，庆阳市中凯农产品有限责任公司提供；芦丁标准品，购自中国药品生物制品研究所；氢氧化钾，分析纯，购自西安化学试剂厂；乙醇，分析纯，购自西安化学试剂厂；无水乙醇，分析纯，购自西安化学试剂厂；去离子水。
1.3方法
1.3.1
对照品溶液的配制。精密称取105 ℃干燥恒重的芦丁对照品0.01 g，加80%乙醇溶液定容至100 mL，作为浓度为0.1 mg/mL的标准溶液。
1.3.2
样品溶液的配制。称取粉碎后过筛（60目）的甘草渣5.0 g，置250 mL容量瓶中，加80%乙醇150 mL，超声提取（功率200 W，频率40 kHz）30 min，过滤，滤渣再加入80%乙醇100 mL，超声处理20 min，过滤，合并2次滤液，冷却至室温后用80%乙醇稀释至一定量，摇匀过滤，弃去初滤液，续滤液即为样品溶液。
1.3.3
显色溶液的配制。准确吸收芦丁对照品溶液和样品溶液各1.0 mL，置于10 mL的容量瓶，分别加入0.5 mL 10% KOH溶液作为显色剂，室温放置5 min，用80%乙醇稀释至一定量，摇匀，即得对照品或样品的显色溶液。
1.3.4
最大吸收波长的选择。准确吸收芦丁对照品溶液和样品溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶，分别加入0.5 mL 10% KOH溶液作为显色剂，室温放置5 min，用80%乙醇稀释至一定量，摇匀，于300～600 nm波长处扫描，确定最大吸收波长。
1.3.5方法学考察。
1.3.5.1 线性关系考察。精确吸取0.1 mg/mL的芦丁对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于10 mL的试管中，分别加入80%乙醇5.0 mL，再加0.5 mL 10% KOH 溶液，充分摇匀显色5 min后，用80%乙醇定容至10 mL，摇匀，以不加样品的溶液为参比液，在最大吸收峰处测定其吸光度值。以吸光度（A）为纵坐标、芦丁对照品溶液的质量浓度（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线。
1.3.5.2精密度试验。取同一对照品溶液1.0 mL，按照“1.3.3”方法显色稳定5 min后连续测定吸光度5次，计算RSD。
1.3.5.3
稳定性试验。精密量取样品溶液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，按“1.3.3”方法显色后，分别在80 min内每10 min在最大波长处测定吸光度。
1.3.5.4
重复性试验。取同一批甘草渣粉末6份，精密称定，按“1.3.2”方法制备样品溶液，按照“1.3.5.1”方法测定吸光度。
1.3.5.5
加样回收试验。分别准确量取已知总黄酮含量为0.023 mg/mL的1 mL提取液6份，分别加入一定量的蘆丁标准品，按“1.3.5.1”方法测定吸光度，计算加样回收率。
1.3.6
样品总黄酮含量的测定。精密吸取样品溶液3份，每份均为0.5 mL，按“1.3.4”方法于最大波长处测定吸光度，将试样的吸光度平均值带入标准曲线方程，计算样品中总黄酮含量。
2结果与分析
2.1显色剂用量的确定
准确移取1.0 mL样液于10 mL容量瓶，分别加不同用量（0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL）的显色剂（10% KOH溶液），室温放置5 min，用80%乙醇定容，摇匀；用加样品不加显色液的溶液作空白对照，在最大波长处测定其吸光度（3个平行）。以吸光度（A）为纵坐标、KOH用量（mg/mL）为横坐标绘制曲线（图1）。
图1显色剂用量与吸光度的关系
Fig.1The relationship between the dosages of chromogenic agent and absorbance
由图1可知，随着显色剂用量的增加，吸光度逐渐增大，这是因为显色剂与样品溶液发生反应所致；当显色剂用量>0.5 mL后，吸光度又开始减小，而后，随着显色剂用量的增
加，样品溶液所需的显色剂量达到饱和，吸光度变化幅度不
太明显，再随着显色剂量的增加，吸光度发生突跃。由于显色剂的用量是在最大波长处测量，且鉴于方便和节约时间考虑，故选择0.5 mL为最佳显色剂用量。
2.2显色时间的确定
准确移取1.0 mL样液于10 mL容量瓶，精密加入0.5 mL的显色剂（10%氢氧化钾溶液），室温放置不同时间（0、2、5、10、20、30、60 min ）后，用80%乙醇定容，摇匀；用80%乙醇作空白对照，在最大波长处测定其吸光度（3个平行）。以吸光度（A）为纵坐标、时间（min）为横坐标绘制曲线（图2）。
由图2可知，随着显色时间的增加，吸光度逐渐增大，这是因为随着时间的增加，样品溶液与显色剂间的反应进行的比较充分；当显色时间>5 min后，样品溶液与显色剂间的反应进行完全，吸光度基本没有变化，再随着显色时间的增加，吸光度增加，而后随着显色时间的增加，吸光度变化不太明显。由于显色时间是在最大波长处测量，且鉴于方便和节约时间考虑，故选择5 min为最佳显色时间。
2.3最大吸收波长的选择
由图3可知，对照品显色溶液与样品显色溶液最大吸收波长很接近，故选择409 nm为试验的测定波长。
2.4方法学考察
2.4.1
标准曲线的绘制。按照“1.3.5.1”方法操作，以吸光度（A）为纵坐标、芦丁对照品溶液的质量浓度（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线（图4），得线性回归方程：y=32.336x-0.012 9（R2=0.994 5），表明该试验方法相对来说比较合理，所得曲线较为理想。
2.4.2
精密度试验。同一份样品连续5次进样，吸光度的RSD为1.7%，表明仪器精密度良好。
2.4.3稳定性试验。按照“1.3.5.3”操作，结果发现吸光度随时间的变化而变化，到一定时间后趋于稳定。计算RSD为1.3%，表明供试品溶液在80 min内稳定性良好。
2.4.4重复性试验。按照“1.3.5.4”操作，计算得出6份样品总黄酮含量的RSD为1.6%，表明该方法重复性良好。
2.4.5
加样回收率试验。由表1可知，甘草渣中总黄酮的平均加樣回收率为88%，RSD为1.3%，说明该方法的加样回收率较高。
2.5样品含量测定按“1.3.6”的方法，计算样品中总黄酮的含量为2.24%。
3小结
以80%乙醇为提取溶剂，10%KOH为显色剂，采用紫外分光光度法测定甘草渣中总黄酮含量；并且考察了显色时间
和显色剂用量。结果表明，总黄酮含量最高时的最佳显色时
间为5 min，显色剂用量为0.5 mL，试剂乙醇浓度为80%，最大吸收峰在409 nm波长处；此时甘草渣中总黄酮的含量为224%。
参考文献
[1] 谷会岩.中国甘草资源生态学研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2001.
[2] 郑虎占，董泽宏，佘靖.中药现代研究与应用[M].北京：学苑出版社，1997： 1256-1279.
[3] 崔永明.甘草次生代谢产物分离纯化研究[D].武汉：华中科技大学，2005.
[4] 乔仲和，胡自如.甘草渣中大量黄酮类化合物的分离及甘草的综合开发研究[J].中草药，1997，28（9）： 522-524.
[5] 吴伟康，奉建芳，黄小蕊，等.甘草提取工艺的初步研究[J].中草药，2001，32（3）： 211-212.
[6] 封士兰.甘草黄酮的提取分离和含量测定[J].兰州医学院学报，1998，24（4）： 20-21.