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摘 要：建立一种灵敏的检测人血液中劳拉西泮的GC-MS检测方法。该方法在PH=9条件下，以奥沙西泮作为内标物，采用氯仿对血液样品进行液-液萃取。提取物用碘化丙烷和丙酸酐两步衍生化，用GC-MS法进行检测。最大回收率为93.7%，平均回收率为88.5%。分析方法的检测限为4.5 ng/ml，定量限为15.0 ng/ml。
关键词： 劳拉西泮；血浆；衍生化
劳拉西泮（Lorazepam），又称作劳拉安定、氯羟安定和氯羟去甲安定，属于新型苯二氮卓类药物。具有抗惊厥、镇静、催眠、缓解酒精中毒等作用，也可以应用到艾滋病、抗抑郁、安眠、消炎止痛等治疗领域。劳拉西泮比现有的常用苯二氮卓类药物毒性小、用量低、对自主神经失调症、心脏神经症等引起的紧张不安、焦虑和忧郁有良好的效果，成为治疗焦虑的主流用药，国内外销售势头良好。
由于该类药物容易得到，使用剂量小，体内代谢快，常被犯罪分子作为麻醉药物用于麻醉抢劫等麻醉后犯罪。另外自杀、误服等原因引起中毒也不在少数。目前已成为临床和刑事检验中常见的一类药物。为了确证这类案件的性质，经常需要对受害人的血、尿等体液中麻醉药物或其代谢物进行检测。劳拉西泮药物在人体内代谢简单，基本上与葡萄糖醛酸形成非活性结合代谢物随尿液排出，需水解释放原体后才能检验，而在血液、脏器组织中以原体存在，可直接进行分离检测。有文献报道，劳拉西泮口服吸收效果良好，口服该药2 mg（治疗剂量）2小时 后，血液中药物浓度达到最高值16.9 μg/L，之后以半衰期12小时 的速率降低。麻醉剂量要高于治疗剂量。目前已报道血液中劳拉西泮的检测方法大多采用气相色谱-氮磷检测器、高效液相色谱法、气质联用和液质联用法等，有的色谱法采用了紫外分析检测器、二极管阵列检测器等，甚至采用MS-MS联用。由于该类设备昂贵，考虑到目前并不是所有司法检测和刑事案件物证鉴定实验室都有能力配备如此昂贵的检测设备，大多数以气相色谱为主。因此，本文从刑事和司法分析实践出发，结合实际案例，笔者进行了大量的基础实验，我们选择血液样品进行检测，建立了衍生化法检验血液中劳拉西泮的GC-MS方法。
1实验部分
1.1色谱仪与色谱条件
Agilent 7890A/7000气质联用仪； 色谱柱：DB-5MS（30m×0.25mm i.d. 膜厚0.25μm）； 载气：氦气 ； 载气流速：1ml/min；进样口和传输线温度：300 ℃； 柱温：120（1min）→10℃/min→295℃（5min）；离子源：电子轰击电离源（EI）；电子能量：70ev；衍生化的奥沙西泮，选取m/z为257、299s作为SIM离子扫描（驻留时间10 m），用于检测分析；衍生化的劳拉西泮，选取m/z为333、335作为SIM离子扫描（驻留时间10 ms），用于分析和定量目标物。
1.2试剂和药品
劳拉西泮（中国药品生物制品检定所，100mg）。
奥沙西泮（中国药品生物制品检定所，50mg）。
丙基碘（东京化成工业株式会社，含量>98.0 %）。
四甲基氢氧化铵（东京化成工业株式会社，10%的甲醇溶液）。
三乙基胺（东京化成工业株式会社，含量>99.0%）。
丙酸酐（东京化成工业株式会社，含量>99 %）。
Na2HPO4（东京化成工业株式会社，含量>99 %）。
乙腈（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯）。
甲苯（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯）；。
正己烷（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯）。
三氯甲烷（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯）。
试验用血液（均采用健康人的血液，并在使用前通过GC/MS对劳拉西泮及奥沙西泮进行预检测）。
1.3标准溶液的制备
标准储备液的制备：分别精密称量适量劳拉西泮、奥沙西泮标准品，配置成浓度均为1mg/ml的标准储备液，置于冰箱内保存备用。
标准工作液的制备：精密量取劳拉西泮标准储备液，采用逐级稀释的方法，配置成浓度为15μg/ml，30μg/ml，50μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml的劳拉西泮工作液；内标物奥沙西泮采用同样的方法配置成浓度为50μg/ml的工作液。
1.4血液样本的制作
取空白血液950μl，分别精确量取50μl劳拉西泮标准工作液于空白血液中，配置成含有一定浓度的系列劳拉西泮血液样本。
1.5提取和衍生化步骤
提取：取50.0 μl 50.0ug/ml的奥沙西泮内标工作溶液和1ml的磷酸氢钠缓冲溶液（PH=9.0，0.5M）加入到1ml血液样本中，涡旋混匀后 ，用5ml氯仿进行液液萃取，4200rpm离心15min，重复提取两次，合并有机相并转移到一个干净试管中。在40℃、氮气流下吹干，随后用20 μl乙腈复溶。所得的系列提取液继续进行下两步丙基化和丙酰基化衍生。
衍生化：取50μl四甲基氢氧化铵溶液（2.5%的甲醇溶液）和50μl碘丙烷溶液加入到上一步所得提取液中，涡旋混匀后，于65℃水浴下加热15min。冷却至室温后，再加入200μl丙酸酐和三乙胺的混合溶液（1∶1，v/v），涡旋后继续于65℃水浴下加热15min。两步衍生结束后，加入500μl 碳酸氢钠溶液（0.1M）调节PH，后用5ml 正己烷和二氯甲烷的混合液（3∶1，v/v）進行液液萃取，涡旋后于4200rpm离心15min，重复提取两次，合并有机相在40℃、氮气流下吹干，用25μl甲苯复溶，留待上机检测。
2 结果与讨论
通过本文所述衍生化方法，用GC-MS法测定血液中的劳拉西泮可以大大提高其检测灵敏度，图1为劳拉西泮和奥沙西泮衍生化后的色谱图，图2为劳拉西泮和奥沙西泮衍生化后的质谱图，为确定本文所述检测方法的有效性，本文通过以下方法对本方法进行了方法学确认。 2.1 线性范围及检测限
取空白血液检材6份，添加劳拉西泮标准品及奥沙西泮内标物，配制成系列浓度含有内标物标准品的血液样本，按上述实验步骤进行样本的提取和衍生化，以待测物与内标物浓度比值为横坐标，以待测物与内标物峰面积比值为纵坐标，得其线性方程、相关系数R以及检出限（如表1），结果显示，待测物在15μg/ml～300μg/ml范围内线性关系良好。
2.2 加样回收实验
按本文所述实验方法，在空白血液中添加不同浓度的劳拉西泮标准品，进行加样回收实验，结果显示，其回收率均在80%以上（如表2）。
2.3特异性实验
为检测本文所述实验方法对劳拉西泮检测的特异选择性，在空白血样中加入了一定浓度的甲基苯丙胺，可卡因，可待因，麻黄素，毒鼠强，敌敌畏及劳拉西泮，按照上述实验方法进行检测，结果显示，在这些药品的存在下，通过本文所述实验方法仍然能高效精确的检测出劳拉西泮。
3 结论
本实验选取血液作为定性和定量的检材，建立了劳拉西泮的GC-MS分析方法。该方法在PH=9条件下，以奥沙西泮为内标物，采用氯仿对血浆样品进行液-液萃取。提取物用碘化丙烷和丙酸酐两步衍生化，用GC-MS气相色谱进行检测。实验数据所得最大回收率为93.7%，平均回收率为88.5%。分析方法的检测限为4.50 ng/ml，定量限为15.0 ng/ml。
该方法样品前处理过程简便，检测快速、准确、可靠、实用性强，适用于法医毒物分析及临床急救事件，也可应用于劳拉西泮临床血药浓度检测和药物动力学研究。
由于苯二氮卓类药物结构和性质比较相似，因此，本实验也为相关苯二氮卓类药物进一步分析检测提供了一定的参考依据。
参考文献：
[1]S.J.Marin，R.Coles，M.Merrell，G.A.McMillin，Quantitation of benzodiazepines in urine， serum， plasma， and meconium by LC-MS-MS [J].Anal Toxicol， 2008，32：491-498.
[2]G.Ngwa，D.Fritch， K. Blum， G. Newland， Simultaneous analysis of 14 benzodiazepines in oral fluid by solid-phase extraction and LC-MS-MS [J].Anal. Toxicol， 2007， 31：369-376.
[3]Greenblatt David J， Shader Richard I. Clin PharmacolTher， 1976，20（3）：329-341.
[4]姜兆林，譚家锰，姚丽鹃等.气相色谱一氮磷检测法检测尿中劳拉西浮[J].色谱，200l，19（4）：341.
关键词： 劳拉西泮；血浆；衍生化
劳拉西泮（Lorazepam），又称作劳拉安定、氯羟安定和氯羟去甲安定，属于新型苯二氮卓类药物。具有抗惊厥、镇静、催眠、缓解酒精中毒等作用，也可以应用到艾滋病、抗抑郁、安眠、消炎止痛等治疗领域。劳拉西泮比现有的常用苯二氮卓类药物毒性小、用量低、对自主神经失调症、心脏神经症等引起的紧张不安、焦虑和忧郁有良好的效果，成为治疗焦虑的主流用药，国内外销售势头良好。
由于该类药物容易得到，使用剂量小，体内代谢快，常被犯罪分子作为麻醉药物用于麻醉抢劫等麻醉后犯罪。另外自杀、误服等原因引起中毒也不在少数。目前已成为临床和刑事检验中常见的一类药物。为了确证这类案件的性质，经常需要对受害人的血、尿等体液中麻醉药物或其代谢物进行检测。劳拉西泮药物在人体内代谢简单，基本上与葡萄糖醛酸形成非活性结合代谢物随尿液排出，需水解释放原体后才能检验，而在血液、脏器组织中以原体存在，可直接进行分离检测。有文献报道，劳拉西泮口服吸收效果良好，口服该药2 mg（治疗剂量）2小时 后，血液中药物浓度达到最高值16.9 μg/L，之后以半衰期12小时 的速率降低。麻醉剂量要高于治疗剂量。目前已报道血液中劳拉西泮的检测方法大多采用气相色谱-氮磷检测器、高效液相色谱法、气质联用和液质联用法等，有的色谱法采用了紫外分析检测器、二极管阵列检测器等，甚至采用MS-MS联用。由于该类设备昂贵，考虑到目前并不是所有司法检测和刑事案件物证鉴定实验室都有能力配备如此昂贵的检测设备，大多数以气相色谱为主。因此，本文从刑事和司法分析实践出发，结合实际案例，笔者进行了大量的基础实验，我们选择血液样品进行检测，建立了衍生化法检验血液中劳拉西泮的GC-MS方法。
1实验部分
1.1色谱仪与色谱条件
Agilent 7890A/7000气质联用仪； 色谱柱：DB-5MS（30m×0.25mm i.d. 膜厚0.25μm）； 载气：氦气 ； 载气流速：1ml/min；进样口和传输线温度：300 ℃； 柱温：120（1min）→10℃/min→295℃（5min）；离子源：电子轰击电离源（EI）；电子能量：70ev；衍生化的奥沙西泮，选取m/z为257、299s作为SIM离子扫描（驻留时间10 m），用于检测分析；衍生化的劳拉西泮，选取m/z为333、335作为SIM离子扫描（驻留时间10 ms），用于分析和定量目标物。
1.2试剂和药品
劳拉西泮（中国药品生物制品检定所，100mg）。
奥沙西泮（中国药品生物制品检定所，50mg）。
丙基碘（东京化成工业株式会社，含量>98.0 %）。
四甲基氢氧化铵（东京化成工业株式会社，10%的甲醇溶液）。
三乙基胺（东京化成工业株式会社，含量>99.0%）。
丙酸酐（东京化成工业株式会社，含量>99 %）。
Na2HPO4（东京化成工业株式会社，含量>99 %）。
乙腈（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯）。
甲苯（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯）；。
正己烷（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯）。
三氯甲烷（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯）。
试验用血液（均采用健康人的血液，并在使用前通过GC/MS对劳拉西泮及奥沙西泮进行预检测）。
1.3标准溶液的制备
标准储备液的制备：分别精密称量适量劳拉西泮、奥沙西泮标准品，配置成浓度均为1mg/ml的标准储备液，置于冰箱内保存备用。
标准工作液的制备：精密量取劳拉西泮标准储备液，采用逐级稀释的方法，配置成浓度为15μg/ml，30μg/ml，50μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml的劳拉西泮工作液；内标物奥沙西泮采用同样的方法配置成浓度为50μg/ml的工作液。
1.4血液样本的制作
取空白血液950μl，分别精确量取50μl劳拉西泮标准工作液于空白血液中，配置成含有一定浓度的系列劳拉西泮血液样本。
1.5提取和衍生化步骤
提取：取50.0 μl 50.0ug/ml的奥沙西泮内标工作溶液和1ml的磷酸氢钠缓冲溶液（PH=9.0，0.5M）加入到1ml血液样本中，涡旋混匀后 ，用5ml氯仿进行液液萃取，4200rpm离心15min，重复提取两次，合并有机相并转移到一个干净试管中。在40℃、氮气流下吹干，随后用20 μl乙腈复溶。所得的系列提取液继续进行下两步丙基化和丙酰基化衍生。
衍生化：取50μl四甲基氢氧化铵溶液（2.5%的甲醇溶液）和50μl碘丙烷溶液加入到上一步所得提取液中，涡旋混匀后，于65℃水浴下加热15min。冷却至室温后，再加入200μl丙酸酐和三乙胺的混合溶液（1∶1，v/v），涡旋后继续于65℃水浴下加热15min。两步衍生结束后，加入500μl 碳酸氢钠溶液（0.1M）调节PH，后用5ml 正己烷和二氯甲烷的混合液（3∶1，v/v）進行液液萃取，涡旋后于4200rpm离心15min，重复提取两次，合并有机相在40℃、氮气流下吹干，用25μl甲苯复溶，留待上机检测。
2 结果与讨论
通过本文所述衍生化方法，用GC-MS法测定血液中的劳拉西泮可以大大提高其检测灵敏度，图1为劳拉西泮和奥沙西泮衍生化后的色谱图，图2为劳拉西泮和奥沙西泮衍生化后的质谱图，为确定本文所述检测方法的有效性，本文通过以下方法对本方法进行了方法学确认。 2.1 线性范围及检测限
取空白血液检材6份，添加劳拉西泮标准品及奥沙西泮内标物，配制成系列浓度含有内标物标准品的血液样本，按上述实验步骤进行样本的提取和衍生化，以待测物与内标物浓度比值为横坐标，以待测物与内标物峰面积比值为纵坐标，得其线性方程、相关系数R以及检出限（如表1），结果显示，待测物在15μg/ml～300μg/ml范围内线性关系良好。
2.2 加样回收实验
按本文所述实验方法，在空白血液中添加不同浓度的劳拉西泮标准品，进行加样回收实验，结果显示，其回收率均在80%以上（如表2）。
2.3特异性实验
为检测本文所述实验方法对劳拉西泮检测的特异选择性，在空白血样中加入了一定浓度的甲基苯丙胺，可卡因，可待因，麻黄素，毒鼠强，敌敌畏及劳拉西泮，按照上述实验方法进行检测，结果显示，在这些药品的存在下，通过本文所述实验方法仍然能高效精确的检测出劳拉西泮。
3 结论
本实验选取血液作为定性和定量的检材，建立了劳拉西泮的GC-MS分析方法。该方法在PH=9条件下，以奥沙西泮为内标物，采用氯仿对血浆样品进行液-液萃取。提取物用碘化丙烷和丙酸酐两步衍生化，用GC-MS气相色谱进行检测。实验数据所得最大回收率为93.7%，平均回收率为88.5%。分析方法的检测限为4.50 ng/ml，定量限为15.0 ng/ml。
该方法样品前处理过程简便，检测快速、准确、可靠、实用性强，适用于法医毒物分析及临床急救事件，也可应用于劳拉西泮临床血药浓度检测和药物动力学研究。
由于苯二氮卓类药物结构和性质比较相似，因此，本实验也为相关苯二氮卓类药物进一步分析检测提供了一定的参考依据。
参考文献：
[1]S.J.Marin，R.Coles，M.Merrell，G.A.McMillin，Quantitation of benzodiazepines in urine， serum， plasma， and meconium by LC-MS-MS [J].Anal Toxicol， 2008，32：491-498.
[2]G.Ngwa，D.Fritch， K. Blum， G. Newland， Simultaneous analysis of 14 benzodiazepines in oral fluid by solid-phase extraction and LC-MS-MS [J].Anal. Toxicol， 2007， 31：369-376.
[3]Greenblatt David J， Shader Richard I. Clin PharmacolTher， 1976，20（3）：329-341.
[4]姜兆林，譚家锰，姚丽鹃等.气相色谱一氮磷检测法检测尿中劳拉西浮[J].色谱，200l，19（4）：341.