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摘要：目的：本实验通过将骨髓间充质干细胞（MSCs）注射于兔下颌骨牵张成骨处后，了解 MSCs 对牵张成骨处促进成骨的机制。方法：实验组将 MSCs 注射于右侧牵张成骨处，而对照组注入等量的生理盐水。X线图像分析系统计算新生骨生成区的平均灰度值。免疫组化的方法检测牵张成骨处新生骨组织中骨保护素的表达。结果：兔下颌骨牵张成骨实验动物模型造模成功，MSCs注射可促进牵张区骨量增加，局部组织中骨保护素的表达明显高于对照组。结论：MSCs的促成骨作用可能通过表达骨保护素来实现。
关键词：牵引成骨；骨髓间充质干细胞；载体；骨保护素
Abstract：
Key words：Objective： this experiment by injecting bone marrow mesenchymal stem cells （MSCs） between in rabbit mandibular stretching， understanding of MSCs to promote osteogenesis mechanism with zhang. Methods： the experimental group injected MSCs in right side with a place， and the control group into the same amount of saline. X-ray image analysis system to calculate the average grey value in new bone formation. Immunohistochemical method of detection with zhang in the expression of new bone tissue of bone protection element. Results： rabbit mandibular stretching experimental animal model building success， MSCs can promote tension zone injection increased bone mass， bone protective element in the local tissue expression is significantly higher than the control group. Conclusion： MSCs role in contributing to bone may through the expression of bone protection have achieved.
【中图分类号】
R551.3 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）07-0009-02
牵张成骨（ distraction osteogenesis， DO）是一种内源性骨组织工程技术，主要是通过将骨骼切开，并在切骨线两侧安放特制的牵张器，在牵张力的作用下，切骨间隙逐渐增宽，从而达到延长骨骼目的。是目前国内外口腔颌面外科领域的研究热点之一[1]。骨髓间充质干细胞（ Mesenehymal Stem Cell， MSCs）是一群具有多向分化潜能的干细胞，在体外特定的诱导条件下可以分化为骨、软骨、神经、脂肪、肌肉及肝等多种功能细胞。骨保护素（osteoprotegerin， OPG）是一种新的肿瘤坏死因子受体家族成员， 能够竞争性地与核因子-kB 配体结合，抑制破骨细胞活化，参与骨形成和改建，在骨的代谢平衡过程中起到极其重要作用。本实验通过检测骨的牵张间隙内注射MSCs后局部组织中的OPG表达情况，进一步阐释其促成骨作用的机理。
1 材料与方法
1.1 日本大耳白兔 20只 兔下颌骨牵引器 ）、 SABC免疫组化试剂盒和 OPG多克隆抗体
1.2 兔骨髓间质干细胞的体外培养及鉴定
1.3 兔单侧下颌骨DO模型的建立及实验分组：实验动物麻醉成功后，常规皮肤消毒，暴露右侧下颌体，行下颌骨切开术并将牵张器固定于口外。术后连续五天肌注青霉素，预防术后感染，流食饲养。经过5天的间歇期后，以1mm/d速度进行牵张，分2次，每次间隔 12小时，向前缓慢延长下颌骨，连续牵引5天 ，即延长下颌骨5mm后固定牵引器。
所有动物随机分为实验组和对照组，每组10只。在安装固定牵引器后第1天，实验组动物麻醉后，消毒牵张区皮肤，用注射器在牵张间隙内注入150μl MSC悬液，细胞总量约1×106，对照组注入等量生理盐水。
1.4 牵张区新生骨量测定：保持放射条件不变：64kV，6.5mA暴光0.45秒，分别在固定期的第1天、3天、5天、7天对实验动物下颌骨处进行常规摄片，观察牵引区的新生骨的骨密度。用X线图像分析系统计算牵张区新生骨的平均灰度值。
1.5 免疫组化染色法检测 OPG 的表达：全部实验动物于固定期第7天麻醉下处死，取下颌骨标本，采用SABC法严格按照免疫组化染色试剂盒操作说明进行 OPG 的免疫组化染色，病理图像分析系统计算牵张区OPG阳性面积的百分比。
1.6 统计学分析：计量资料用X±s表示，两样本t检验，通过SPSS16.0软件包进行统计分析，* P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 牵张区新生骨量的影像学观察：如表1所示，固定期随着时间延长，牵张区新生骨密度逐渐增加，经过MSCs注射的实验组新生骨灰度值较对照组增加明显，差异有统计学意义。
表1 各组牵引成骨区新生成骨的平均灰度值（X±S，n=10）
*表示该组与对照组比较有显著性差异（P<0.05）
2.2 OPG在牵张区骨组织中的表达：免疫组化染色结果显示OPG主要位于牵张成骨区处成纤维细胞，新生骨小梁周围的成骨细胞附近。阳性表达表现为胞浆组织内有棕黄色颗粒，苏木素复染细胞核为蓝紫色。实验组牵张区OPG表达明显高于对照组，如表2所示。
3 讨论
牵张成骨术一般都会有一个延迟期，即从手术结束到开始牵引的这一段时间。在牵引期中，最为重要的因素为选择牵引的速率和频率。Ilizarov等[1]人发现：以每天1.0mm的牵张速度行连续牵引能够取得最佳成骨效果。这种观点得到了后来Meyer等[2]和Carl等[3]等人的研究所支持。此外Ilizarov等人尝试采用每天2.0mm速度牵引， 4周后发现，断端大部分被结缔组织所填充，从而进一步说明以上观点。这些研究成果为牵引成骨技术的临床应用奠定了科学基础。我们可以利用骨髓间质干细胞局部注射于牵张成骨处促进骨组织及周围组织愈合这一特点，将骨髓间质干细胞应用于临床中去，提高骨愈合的能力，减少牵张成骨术带来的痛苦，缩短疗程。
表2 两组牵引成骨区OPG表达的比较（X±S，n=10）
参考文献
[1] 周诺.牵张成骨研究中的几个热点问题[J].口腔颌面外科杂志.2011，21（4）：229-237.
[2] 戚孟春，胡静， 邹淑娟等. 骨髓间充质干细胞移植促进大鼠下颌骨牵张成骨的实验研究[J].中国口腔颌面外科杂志，2005， 3（2）：151-154.
[3] 郭伟，王麓山.骨保护素在骨相关疾病领域的研究进展[J].中国矫形外科杂志，2013，21（24）：2499-2502.
[4] 付颖， 董庆文， 王稚英. 骨保护素在兔下颌牵张后新骨组织中的表达[J].锦州医学院学报， 2006，27（3）：31-32.
关键词：牵引成骨；骨髓间充质干细胞；载体；骨保护素
Abstract：
Key words：Objective： this experiment by injecting bone marrow mesenchymal stem cells （MSCs） between in rabbit mandibular stretching， understanding of MSCs to promote osteogenesis mechanism with zhang. Methods： the experimental group injected MSCs in right side with a place， and the control group into the same amount of saline. X-ray image analysis system to calculate the average grey value in new bone formation. Immunohistochemical method of detection with zhang in the expression of new bone tissue of bone protection element. Results： rabbit mandibular stretching experimental animal model building success， MSCs can promote tension zone injection increased bone mass， bone protective element in the local tissue expression is significantly higher than the control group. Conclusion： MSCs role in contributing to bone may through the expression of bone protection have achieved.
【中图分类号】
R551.3 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）07-0009-02
牵张成骨（ distraction osteogenesis， DO）是一种内源性骨组织工程技术，主要是通过将骨骼切开，并在切骨线两侧安放特制的牵张器，在牵张力的作用下，切骨间隙逐渐增宽，从而达到延长骨骼目的。是目前国内外口腔颌面外科领域的研究热点之一[1]。骨髓间充质干细胞（ Mesenehymal Stem Cell， MSCs）是一群具有多向分化潜能的干细胞，在体外特定的诱导条件下可以分化为骨、软骨、神经、脂肪、肌肉及肝等多种功能细胞。骨保护素（osteoprotegerin， OPG）是一种新的肿瘤坏死因子受体家族成员， 能够竞争性地与核因子-kB 配体结合，抑制破骨细胞活化，参与骨形成和改建，在骨的代谢平衡过程中起到极其重要作用。本实验通过检测骨的牵张间隙内注射MSCs后局部组织中的OPG表达情况，进一步阐释其促成骨作用的机理。
1 材料与方法
1.1 日本大耳白兔 20只 兔下颌骨牵引器 ）、 SABC免疫组化试剂盒和 OPG多克隆抗体
1.2 兔骨髓间质干细胞的体外培养及鉴定
1.3 兔单侧下颌骨DO模型的建立及实验分组：实验动物麻醉成功后，常规皮肤消毒，暴露右侧下颌体，行下颌骨切开术并将牵张器固定于口外。术后连续五天肌注青霉素，预防术后感染，流食饲养。经过5天的间歇期后，以1mm/d速度进行牵张，分2次，每次间隔 12小时，向前缓慢延长下颌骨，连续牵引5天 ，即延长下颌骨5mm后固定牵引器。
所有动物随机分为实验组和对照组，每组10只。在安装固定牵引器后第1天，实验组动物麻醉后，消毒牵张区皮肤，用注射器在牵张间隙内注入150μl MSC悬液，细胞总量约1×106，对照组注入等量生理盐水。
1.4 牵张区新生骨量测定：保持放射条件不变：64kV，6.5mA暴光0.45秒，分别在固定期的第1天、3天、5天、7天对实验动物下颌骨处进行常规摄片，观察牵引区的新生骨的骨密度。用X线图像分析系统计算牵张区新生骨的平均灰度值。
1.5 免疫组化染色法检测 OPG 的表达：全部实验动物于固定期第7天麻醉下处死，取下颌骨标本，采用SABC法严格按照免疫组化染色试剂盒操作说明进行 OPG 的免疫组化染色，病理图像分析系统计算牵张区OPG阳性面积的百分比。
1.6 统计学分析：计量资料用X±s表示，两样本t检验，通过SPSS16.0软件包进行统计分析，* P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 牵张区新生骨量的影像学观察：如表1所示，固定期随着时间延长，牵张区新生骨密度逐渐增加，经过MSCs注射的实验组新生骨灰度值较对照组增加明显，差异有统计学意义。
表1 各组牵引成骨区新生成骨的平均灰度值（X±S，n=10）
*表示该组与对照组比较有显著性差异（P<0.05）
2.2 OPG在牵张区骨组织中的表达：免疫组化染色结果显示OPG主要位于牵张成骨区处成纤维细胞，新生骨小梁周围的成骨细胞附近。阳性表达表现为胞浆组织内有棕黄色颗粒，苏木素复染细胞核为蓝紫色。实验组牵张区OPG表达明显高于对照组，如表2所示。
3 讨论
牵张成骨术一般都会有一个延迟期，即从手术结束到开始牵引的这一段时间。在牵引期中，最为重要的因素为选择牵引的速率和频率。Ilizarov等[1]人发现：以每天1.0mm的牵张速度行连续牵引能够取得最佳成骨效果。这种观点得到了后来Meyer等[2]和Carl等[3]等人的研究所支持。此外Ilizarov等人尝试采用每天2.0mm速度牵引， 4周后发现，断端大部分被结缔组织所填充，从而进一步说明以上观点。这些研究成果为牵引成骨技术的临床应用奠定了科学基础。我们可以利用骨髓间质干细胞局部注射于牵张成骨处促进骨组织及周围组织愈合这一特点，将骨髓间质干细胞应用于临床中去，提高骨愈合的能力，减少牵张成骨术带来的痛苦，缩短疗程。
表2 两组牵引成骨区OPG表达的比较（X±S，n=10）
参考文献
[1] 周诺.牵张成骨研究中的几个热点问题[J].口腔颌面外科杂志.2011，21（4）：229-237.
[2] 戚孟春，胡静， 邹淑娟等. 骨髓间充质干细胞移植促进大鼠下颌骨牵张成骨的实验研究[J].中国口腔颌面外科杂志，2005， 3（2）：151-154.
[3] 郭伟，王麓山.骨保护素在骨相关疾病领域的研究进展[J].中国矫形外科杂志，2013，21（24）：2499-2502.
[4] 付颖， 董庆文， 王稚英. 骨保护素在兔下颌牵张后新骨组织中的表达[J].锦州医学院学报， 2006，27（3）：31-32.