论文部分内容阅读
【摘要】目的 观察阿拉瑞林对HEC-1B裸鼠移植瘤的抑制作用及对Bcl-2、Bax表达的影响。方法 将HEC-1B荷瘤鼠随机分为4组:对照组、化疗组、阿拉瑞林组和联合组。30天后处死裸鼠,称取移植瘤重量,观察抑瘤率,免疫组化SABC法检测移植瘤Bcl-2、Bax的表达。结果 阿拉瑞林组抑瘤率为16.9%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),免疫组化结果显示,各治疗组Bcl-2的表达水平明显下降,Bax的表达水平明显上调。结论 阿拉瑞林有一定的抑制子宫内膜癌生长的作用,可能通过对Bcl-2、Bax的表达调控来实现,且与5-Fu有协同作用。
【关键词】子宫内膜癌阿拉瑞林移植瘤裸鼠Bcl-2Bax
【中图分类号】R246.3 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2010)01-00-02
【Abstract】ObjectiveThis study is to observe the effect of alarelin Decoction in inhibiting the growth of transplanting HEC-1B cells in nude mice and the expression of Bcl-2、Bax. Methods : Nude mice with transplanted HEC-1B tumor were randomly divided into four groups: control group, 5-Fu treated group , alarelin treated group, 5-Fu plus alarelin treatedgroup. At day 30 after treatment, the nude mice were executed, then the tumor was weighed, The inhibitive rates of the tumor in nude mice was observed and immunohistochemistry withSABC staining method were used to detect the expression ofBcl-2、Bax. Results: The inhibitive rates of the tumor in alarelin treated group was 16.9%,theaverage tumor weight had significant difference with that in control group(P<0.01); The Bcl-2 expression determined by immunohistochemical staining was down-regulated , but the Bax expression up-regulated after treatment.Conclusionsalarelin has good effect in inhibiting the growth of endometrial cancerby regulating Bcl-2、Bax expression and enhance the anti-tumor effect of 5-Fu.
【Key words】endometrial cancer; alarelin; xenograft; nude mice;Bcl-2;Bax.
子宫内膜癌是原发于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤,占女性生殖系统最常见恶性肿瘤的20%～30%,近些年发病率不断上升。子宫内膜癌的治疗早期以手术为主,但晚期、复发性及年轻要求保留生育能力的患者,以激素及化疗等姑息治疗为主[1],现有的化疗单药或联合用药方案不良反应大、疗效不佳是其主要缺点。阿拉瑞林是人工合成的促性腺激素释放激素(gonadotrop in-releasing hormone, GnRH)九肽类似物,其药效是母体的15倍[2]。本研究通过观察阿拉瑞林对子宫内膜癌的促凋亡作用,探讨可能的分子机制,为子宫内膜癌提供新的治疗方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物及细胞株 BALB/C nu/nu裸鼠,4～6周龄,雌性,体重18～20g购于北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号:SCXK(京)2007-0001,SPF级环境饲养;人子宫内膜癌细胞株HEC-1B购自中国医学科学院上海研究所。
1.1.2 药物与试剂 阿拉瑞林购自安徽丰原制药有限公司马鞍山制药厂;5-氟尿嘧啶购自上海旭东海普药业有限公司;bcl-2、bax试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品;SABC免疫组化染色超敏试剂盒,DAB 染色试剂盒,均购自福州迈新生物技术开发公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及动物模型的建立。 HEC-1B细胞株用含10%胎牛血清、100u/ml庆大霉素的DMEM培养基培养。常规培养于含5%CO2的37℃培养箱中,用0.25%胰酶消化传代继续培养。取对数生长期的细胞,在超净工作台内以TB空针接种于裸鼠右前肢近腋窝处皮下,每只注射0.1ml(约含5×106个细胞),接种完毕后将24只裸鼠随机分为4组,每组6只,SPF级环境下饲养1周,成瘤率为100%,开始给药,给药剂量根据人鼠体表面积折合法计算。阿拉瑞林组:背部肌肉注射35ug/kg,药物浓度按每只裸鼠每次注射1.0ml配制,每日一次,连续30天;对照组:相同剂量的生理盐水;化疗组:腹腔注射5-Fu 20mg/kg,剂量为1.0ml,每日1次,连续5d;联合组:(阿拉瑞林+5-Fu) 阿拉瑞林35ug/kg背部肌肉注射30天,5-Fu20mg/kg腹腔注射5d。停药后处死裸鼠,剥取肿瘤称重后置于福尔马林液中固定,常规石蜡包埋。
1.2.2 指标检测抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。
1.2.3 病理学检查取石蜡包埋组织,切片、HE染色,光镜下观察肿瘤的病理变化。
1.2.4 免疫组化检测Bcl-2、Bax蛋白表达石蜡切片,常规脱蜡至水。PBS洗3次,每次2分钟;0.3%H2O2抑制内源性过氧化物酶10min;蒸馏水洗3次,每次2分钟。热修复抗原,放入0.01M枸橼酸盐缓冲液,微波炉加热至沸腾后断电,间隔10min,反复2次,冷却后PBS洗3次,每次2分钟;滴加一抗,浓度为1:50,4℃过夜,PBS洗3次,每次2分钟;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃40min, PBS洗3次,每次2分钟;滴加SABC,37℃20min, PBS洗4次,每次5分钟;DAB显色,室温5-15分钟,蒸馏水洗涤5min;苏木素轻度复染,脱水、透明、封片。
结果由病理科医师协助分析,参照许良中等[3]的报道:胞浆出现棕黄色颗粒为Bcl-2、Bax阳性细胞。即根据每张切片的阳性细胞比例及着色深浅积分,根据二者乘积判断阳性等级,每例组织观察3个连续切片,每片采样3个400倍视野计数, 阳性细胞所占的百分比打分:0分为阴性,1分为阳性细胞10%,2分为11%～50%,3分为51%～75% ,4分为>75%。再将染色强度打分:0分为无色,1分为淡黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色。将染色强度与阳性细胞百分比的乘积>3分为免疫组化结果( + )。
1.3 统计学处理
应用SPSS13.0软件包,计量资料以均数士标准差(±s)表示,采用方差分析。移植瘤Bcl-2、Bax 蛋白阳性表达率组间比较采用卡方检验,P<0.05为具有统计学意义。
2 结果
(1)阿拉瑞林对移植瘤的重量、抑瘤率的影响(见表1)。在用药过程中,裸鼠生长良好(见图1)。
(2)阿拉瑞林对裸鼠移植瘤组织形态学观察
对照组瘤细胞密集,细胞有明显异型性,核大深染,可见较多核分裂像,间质较少。治疗组瘤细胞排列较稀疏,可见大片无结构的坏死区,瘤细胞核深染、固缩。
(3)免疫组化检测Bcl-2、Bax蛋白表达结果 (见表2、图2)。
3 讨论
阿拉瑞林是对天然的促性腺激素释放激素(GnRH)分子结构进行修饰而合成的肽类物质,对人体无毒,作用时间比GnRH长久。自问世以来广泛应用于临床,这是因为它能与垂体中特异性受体结合,抑制促性腺激素和性激素的释放,造成性腺功能低下,因此,对与性激素有关的疾病具有良好的治疗作用,对于恶性肿瘤,有直接抑制肿瘤细胞增殖、加速其死亡的作用[4],目前它已成功用于治疗乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌[5]等激素依赖性肿瘤。本实验中,各实验组平均瘤重与对照组比较具有显著性差异(P<0.01),阿拉瑞林组、化疗组及联合组两两比较均有显著性差异(P<0.05)。说明阿拉瑞林对子宫内膜癌有抑制作用,且阿拉瑞林与5-Fu在抑制肿瘤生长方面有协同作用。
Bcl-2为凋亡抑制基因,编码Bcl-2,与细胞凋亡关系密切[6],可稳定细胞内质膜系统、抑制线粒体内离子及细胞色素c的释放从而抑制凋亡的发生;Bax则具有对抗Bc1-2抑制细胞凋亡的作用,可促进线粒体内细胞色素c的释放,促进细胞凋亡产生。Bax过量表达, 细胞凋亡[7];Bc1-2过量表达,抑制细胞死亡[8];Bcl-2与Bax的比值决定了细胞接受凋亡信号后细胞的存活与否[9]。在细胞内,Bcl-2和bax可以分别形成同源二聚体,也可以互相聚合形成异源二聚体。当细胞接受某些刺激信号后,如果bcl-2高表达,形成Bcl-2/Bax异二聚体增加,细胞免于凋亡;如果Bax高表达,形成Bcl-2/Bax同源二聚体增加,细胞发生凋亡。本实验中免疫组化结果发现,阿拉瑞林处理的子宫内膜癌细胞中Bcl-2蛋白表达减少,而Bax蛋白表达增加,显然阿拉瑞林能使子宫内膜癌细胞中Bcl-2/Bax比值降低。因此,本实验结果可以证明阿拉瑞林可通过调节Bcl-2和Bax蛋白的表达,来降低二者的比值,进而诱导子宫内膜癌细胞凋亡的发生,启动细胞凋亡的线粒体途径从而诱导细胞凋亡可能是其重要的作用机制之一。阿拉瑞林对细胞凋亡其他方面的作用机制还有待进一步研究。实验中还显示阿拉瑞林与5-Fu在诱导肿瘤细胞凋亡过程中均有Bcl-2表达明显下调,而Bax表达明显上调,Bcl-2/Bax比值下调更加明显,提示两药合用具有协同抗肿瘤作用,因此阿拉瑞林与化疗药物的联合应用可望降低化疗药物剂量而达到相同的疗效,为子宫内膜癌的治疗提供更为有效的方法。
参考文献
[1]Kao MS. Management of recurrent endometrial cancer. Chang Gung Med J 2004;27:639–645.
[2]张超,刘欣燕.GnRH的临床应用进展[J].中国妇产科临床杂志,2007,8(3):229-231.
[3]许良中,杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准[J].中国癌症杂志,1996,6(4):229-231.
[4]田玲,路学智.瑞林类人工合成肽类药物的研究进展[J].中国新药杂志,2006,15(20):1723-1726.
[5]徐虹,宋磊.子宫内膜癌的激素治疗进展,2007,16(1).62-64.
[6]SHANG L,WANG L,SUN H L,et al.Protective effects of oxymatrine on myocyte apoptosis in rats with acute myocardial ischaania[J].Chin Pharm J(中国药学杂志),2007,42(7):501-504.
[7]Hoetelmans R, van Slcoten HJ ,Keijzer R,et al. Bcl22and Bax p roteins are p resent in interphase nuclei ofmammalian cells [J].Cell Death Differ, 2000,7: 384-392
[8]Fan J ,L i R,Zhang R, et al.Effect of Bcl22 and Bax onsurvival of side population cells from hepatocellular car2cinoma cells[ J ].World J Gastroenterol,2007,7:6053-6059
[9]KRAJEW SKI S,KRAJEW SKA M,SHABAIK A,et al.Immunohistochemical determination of in vivo distribution of Bax,adominant inhibitor of Bcl-2[J].Am J Pathol,1994,145(6):1323-1336.
作者单位:山西医科大学第一临床医学院妇产科030001
【关键词】子宫内膜癌阿拉瑞林移植瘤裸鼠Bcl-2Bax
【中图分类号】R246.3 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2010)01-00-02
【Abstract】ObjectiveThis study is to observe the effect of alarelin Decoction in inhibiting the growth of transplanting HEC-1B cells in nude mice and the expression of Bcl-2、Bax. Methods : Nude mice with transplanted HEC-1B tumor were randomly divided into four groups: control group, 5-Fu treated group , alarelin treated group, 5-Fu plus alarelin treatedgroup. At day 30 after treatment, the nude mice were executed, then the tumor was weighed, The inhibitive rates of the tumor in nude mice was observed and immunohistochemistry withSABC staining method were used to detect the expression ofBcl-2、Bax. Results: The inhibitive rates of the tumor in alarelin treated group was 16.9%,theaverage tumor weight had significant difference with that in control group(P<0.01); The Bcl-2 expression determined by immunohistochemical staining was down-regulated , but the Bax expression up-regulated after treatment.Conclusionsalarelin has good effect in inhibiting the growth of endometrial cancerby regulating Bcl-2、Bax expression and enhance the anti-tumor effect of 5-Fu.
【Key words】endometrial cancer; alarelin; xenograft; nude mice;Bcl-2;Bax.
子宫内膜癌是原发于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤,占女性生殖系统最常见恶性肿瘤的20%～30%,近些年发病率不断上升。子宫内膜癌的治疗早期以手术为主,但晚期、复发性及年轻要求保留生育能力的患者,以激素及化疗等姑息治疗为主[1],现有的化疗单药或联合用药方案不良反应大、疗效不佳是其主要缺点。阿拉瑞林是人工合成的促性腺激素释放激素(gonadotrop in-releasing hormone, GnRH)九肽类似物,其药效是母体的15倍[2]。本研究通过观察阿拉瑞林对子宫内膜癌的促凋亡作用,探讨可能的分子机制,为子宫内膜癌提供新的治疗方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物及细胞株 BALB/C nu/nu裸鼠,4～6周龄,雌性,体重18～20g购于北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号:SCXK(京)2007-0001,SPF级环境饲养;人子宫内膜癌细胞株HEC-1B购自中国医学科学院上海研究所。
1.1.2 药物与试剂 阿拉瑞林购自安徽丰原制药有限公司马鞍山制药厂;5-氟尿嘧啶购自上海旭东海普药业有限公司;bcl-2、bax试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品;SABC免疫组化染色超敏试剂盒,DAB 染色试剂盒,均购自福州迈新生物技术开发公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及动物模型的建立。 HEC-1B细胞株用含10%胎牛血清、100u/ml庆大霉素的DMEM培养基培养。常规培养于含5%CO2的37℃培养箱中,用0.25%胰酶消化传代继续培养。取对数生长期的细胞,在超净工作台内以TB空针接种于裸鼠右前肢近腋窝处皮下,每只注射0.1ml(约含5×106个细胞),接种完毕后将24只裸鼠随机分为4组,每组6只,SPF级环境下饲养1周,成瘤率为100%,开始给药,给药剂量根据人鼠体表面积折合法计算。阿拉瑞林组:背部肌肉注射35ug/kg,药物浓度按每只裸鼠每次注射1.0ml配制,每日一次,连续30天;对照组:相同剂量的生理盐水;化疗组:腹腔注射5-Fu 20mg/kg,剂量为1.0ml,每日1次,连续5d;联合组:(阿拉瑞林+5-Fu) 阿拉瑞林35ug/kg背部肌肉注射30天,5-Fu20mg/kg腹腔注射5d。停药后处死裸鼠,剥取肿瘤称重后置于福尔马林液中固定,常规石蜡包埋。
1.2.2 指标检测抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。
1.2.3 病理学检查取石蜡包埋组织,切片、HE染色,光镜下观察肿瘤的病理变化。
1.2.4 免疫组化检测Bcl-2、Bax蛋白表达石蜡切片,常规脱蜡至水。PBS洗3次,每次2分钟;0.3%H2O2抑制内源性过氧化物酶10min;蒸馏水洗3次,每次2分钟。热修复抗原,放入0.01M枸橼酸盐缓冲液,微波炉加热至沸腾后断电,间隔10min,反复2次,冷却后PBS洗3次,每次2分钟;滴加一抗,浓度为1:50,4℃过夜,PBS洗3次,每次2分钟;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃40min, PBS洗3次,每次2分钟;滴加SABC,37℃20min, PBS洗4次,每次5分钟;DAB显色,室温5-15分钟,蒸馏水洗涤5min;苏木素轻度复染,脱水、透明、封片。
结果由病理科医师协助分析,参照许良中等[3]的报道:胞浆出现棕黄色颗粒为Bcl-2、Bax阳性细胞。即根据每张切片的阳性细胞比例及着色深浅积分,根据二者乘积判断阳性等级,每例组织观察3个连续切片,每片采样3个400倍视野计数, 阳性细胞所占的百分比打分:0分为阴性,1分为阳性细胞10%,2分为11%～50%,3分为51%～75% ,4分为>75%。再将染色强度打分:0分为无色,1分为淡黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色。将染色强度与阳性细胞百分比的乘积>3分为免疫组化结果( + )。
1.3 统计学处理
应用SPSS13.0软件包,计量资料以均数士标准差(±s)表示,采用方差分析。移植瘤Bcl-2、Bax 蛋白阳性表达率组间比较采用卡方检验,P<0.05为具有统计学意义。
2 结果
(1)阿拉瑞林对移植瘤的重量、抑瘤率的影响(见表1)。在用药过程中,裸鼠生长良好(见图1)。
(2)阿拉瑞林对裸鼠移植瘤组织形态学观察
对照组瘤细胞密集,细胞有明显异型性,核大深染,可见较多核分裂像,间质较少。治疗组瘤细胞排列较稀疏,可见大片无结构的坏死区,瘤细胞核深染、固缩。
(3)免疫组化检测Bcl-2、Bax蛋白表达结果 (见表2、图2)。
3 讨论
阿拉瑞林是对天然的促性腺激素释放激素(GnRH)分子结构进行修饰而合成的肽类物质,对人体无毒,作用时间比GnRH长久。自问世以来广泛应用于临床,这是因为它能与垂体中特异性受体结合,抑制促性腺激素和性激素的释放,造成性腺功能低下,因此,对与性激素有关的疾病具有良好的治疗作用,对于恶性肿瘤,有直接抑制肿瘤细胞增殖、加速其死亡的作用[4],目前它已成功用于治疗乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌[5]等激素依赖性肿瘤。本实验中,各实验组平均瘤重与对照组比较具有显著性差异(P<0.01),阿拉瑞林组、化疗组及联合组两两比较均有显著性差异(P<0.05)。说明阿拉瑞林对子宫内膜癌有抑制作用,且阿拉瑞林与5-Fu在抑制肿瘤生长方面有协同作用。
Bcl-2为凋亡抑制基因,编码Bcl-2,与细胞凋亡关系密切[6],可稳定细胞内质膜系统、抑制线粒体内离子及细胞色素c的释放从而抑制凋亡的发生;Bax则具有对抗Bc1-2抑制细胞凋亡的作用,可促进线粒体内细胞色素c的释放,促进细胞凋亡产生。Bax过量表达, 细胞凋亡[7];Bc1-2过量表达,抑制细胞死亡[8];Bcl-2与Bax的比值决定了细胞接受凋亡信号后细胞的存活与否[9]。在细胞内,Bcl-2和bax可以分别形成同源二聚体,也可以互相聚合形成异源二聚体。当细胞接受某些刺激信号后,如果bcl-2高表达,形成Bcl-2/Bax异二聚体增加,细胞免于凋亡;如果Bax高表达,形成Bcl-2/Bax同源二聚体增加,细胞发生凋亡。本实验中免疫组化结果发现,阿拉瑞林处理的子宫内膜癌细胞中Bcl-2蛋白表达减少,而Bax蛋白表达增加,显然阿拉瑞林能使子宫内膜癌细胞中Bcl-2/Bax比值降低。因此,本实验结果可以证明阿拉瑞林可通过调节Bcl-2和Bax蛋白的表达,来降低二者的比值,进而诱导子宫内膜癌细胞凋亡的发生,启动细胞凋亡的线粒体途径从而诱导细胞凋亡可能是其重要的作用机制之一。阿拉瑞林对细胞凋亡其他方面的作用机制还有待进一步研究。实验中还显示阿拉瑞林与5-Fu在诱导肿瘤细胞凋亡过程中均有Bcl-2表达明显下调,而Bax表达明显上调,Bcl-2/Bax比值下调更加明显,提示两药合用具有协同抗肿瘤作用,因此阿拉瑞林与化疗药物的联合应用可望降低化疗药物剂量而达到相同的疗效,为子宫内膜癌的治疗提供更为有效的方法。
参考文献
[1]Kao MS. Management of recurrent endometrial cancer. Chang Gung Med J 2004;27:639–645.
[2]张超,刘欣燕.GnRH的临床应用进展[J].中国妇产科临床杂志,2007,8(3):229-231.
[3]许良中,杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准[J].中国癌症杂志,1996,6(4):229-231.
[4]田玲,路学智.瑞林类人工合成肽类药物的研究进展[J].中国新药杂志,2006,15(20):1723-1726.
[5]徐虹,宋磊.子宫内膜癌的激素治疗进展,2007,16(1).62-64.
[6]SHANG L,WANG L,SUN H L,et al.Protective effects of oxymatrine on myocyte apoptosis in rats with acute myocardial ischaania[J].Chin Pharm J(中国药学杂志),2007,42(7):501-504.
[7]Hoetelmans R, van Slcoten HJ ,Keijzer R,et al. Bcl22and Bax p roteins are p resent in interphase nuclei ofmammalian cells [J].Cell Death Differ, 2000,7: 384-392
[8]Fan J ,L i R,Zhang R, et al.Effect of Bcl22 and Bax onsurvival of side population cells from hepatocellular car2cinoma cells[ J ].World J Gastroenterol,2007,7:6053-6059
[9]KRAJEW SKI S,KRAJEW SKA M,SHABAIK A,et al.Immunohistochemical determination of in vivo distribution of Bax,adominant inhibitor of Bcl-2[J].Am J Pathol,1994,145(6):1323-1336.
作者单位:山西医科大学第一临床医学院妇产科030001